乙型肝炎病毒Pre-S/S区基因突变对乙型肝炎病毒表面抗原检测的影响

何成山综述 马晨芸， 陆志成审校

（1.蚌埠医学院，安徽 蚌埠 233000；2.上海中医药大学附属第七人民医院医学检验科，上海 200137）

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是全球公共卫生的重要问题。每年全球由HBV感染相关的急慢性肝炎、肝硬化、肝细胞性肝癌等导致的死亡人数达78.6万[1]。全球有超过2.4亿人为慢性乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）携带者[2]，亚太地区为高度流行区。HBV感染引起的乙型病毒性肝炎（简称乙肝）是重要的传染病之一。我国HBV感染流行率为34.28%，1～59岁人群HBsAg阳性率为7.18%，由此推算我国目前有近5亿人感染过HBV，HBsAg携带者约9 300万[3]，是世界上HBsAg携带人口最多的国家。HBsAg是HBV的外蛋白，可以存在于感染者的血液、体液和分泌物中，是重要的病毒学血清标志物，临床上常将其作为评估HBV感染和抗病毒治疗反应的监测指标。同时，HBsAg还是输血安全的关键筛查指标。目前，我国HBV DNA检测尚未完全开展，HBsAg检测的敏感性和特异性决定着我国输血后乙肝的发生率。

HBV基因型根据S区核苷酸序列异源性主要分为8个基因型，即A、B、C、D、E、F、G和H型，其基因组含4个部分重叠的开放阅读读码框，即编码外膜蛋白的前S/S区（Pre-S/S区）、编码核衣壳蛋白的前C/C区、编码DNA聚合酶的P区和编码X蛋白的X区。Pre-S/S区编码大（L）、中（M）和小（S）3种表面蛋白。S蛋白包含226个氨基酸，即HBsAg；M蛋白包含S蛋白和55个氨基酸长度的pre-S2蛋白，L蛋白包含M蛋白和108～119个氨基酸的Pre-S1蛋白。在HBV基因组中，Pre-S/S区基因在所有开放阅读框中具有较高的突变率，其中主要核心亲水区域（major hydrophilic region，MHR）内“α”决定簇（氨基酸位点124～147）基因序列的突变更为常见。目前，大多数文献认为S蛋白中的“α”决定簇是HBsAg具有免疫原性的区域[4]，其中“α”决定簇的第2个环是HBsAg的主要抗原决定簇[5]。编码“α”决定簇基因序列的上游和内部往往存在多位点突变和氨基酸替代，均可引起抗原构象变化，影响中和抗体的识别。Pre-S/S蛋白突变也会影响病毒的分泌和稳定性，导致循环中病毒量出现低水平。由于上述原因，Pre-S/S区突变会影响体内HBV的清除，从而影响机体免疫反应，使HBV产生免疫逃逸现象，同时还会干扰体外诊断试剂的检测。因此，研究和分析HBV病毒株S区基因MHR常见的突变类型，对于HBV疫苗的研制、乙肝的预防和治疗监测、输血的安全性等都有重要意义。

1 我国HBV S区基因组MHR常见的突变及氨基酸替换

HBV S区基因组MHR编码的“α”决定簇富含半胱氨酸，由C124和C137、C139和C147两两间的二硫键形成2个环形结构，共同维持着HBsAg的构象结构和抗原性。因此，发生在“α”决定簇的单个或多个点突变均可能导致HBsAg的构象和抗原性发生改变。世界各地已广泛报道，慢性乙肝患者感染的HBV常在MHR出现突变，形成突变逃逸株。然而，突变的频率在各个国家不尽相同。在我国，MHR的突变率同样存在明显的地域性差异。LI等[6]对我国广东省东莞地区HBV感染患者MHR变异导致的氨基酸替换进行了研究，结果发现391例慢性HBV感染者中91例存在MHR的氨基酸替换（突变率为24.6%），其中在“α”决定簇内的有48例（突变率为52.7%），发生突变的主要位点为S126、S100、S101、S133、S145、S120、S129。SHI等[7]调查了我国华北地区HBV流行株S基因MHR突变率，发现HBV基因MHR的总体突变频率为46.6%，显著高于LI等[6]的研究结果；其中突变频率高的位点有Q10I（29.9%）、I126T（70.6%）。I126T突变是HBV的C基因型独有的，且频发于我国HBV感染患者。该位点位于“α”决定簇第1个环形结构，其氨基酸改变会导致抗原性的改变，并使HBV毒力增强，这与美国和西欧国家的HBV变异发生模式和发生类型不同。一项由我国23家医院参与的临床研究纳入230例未经治疗的HBV基因型均为C的乙型肝炎e抗原（hepatitis B e antigen，HBeAg）阳性患者，结果显示仅有16.96%的患者感染的HBV S区基因无突变，有83.04%的患者HBV S区基因出现1个或多个位点的突变；这些点突变主要位于“α”决定簇，突变类型有S117T、K122R、I126N/S/T和G145R；同时还发现一些罕见报道的突变位点，如E2G、L21S等；低HBsAg水平患者S区基因突变的频率显著高于高HBsAg水平的患者[8]。DING等[9]的研究结果显示，大约有4.9%的慢性乙肝患者血清中HBsAg和乙型肝炎表面抗体（hepatitis B surface antibody，HBsAb）同时存在，这些患者常表现为“α”决定簇内的点突变或Pre-S缺失突变；与HBsAg阳性的常规模式比较，28例HBsAg和HBsAb双阳性的慢性HBV感染者体内HBV Pre-S区缺失突变更易发生（HBsAg和HBsAb双阳性的突变率为25.0%，HBsAg阳性常规模式的突变率为3.6%）。他们的研究结果还显示，血清HBsAg和HBsAb双阳性患者体内HBV S蛋白的N-末端和MHR出现高频突变，尤其在“α”决定簇存在较多的氨基酸替换，最常见的位点为S126。

HBV的隐匿性感染（occult hepatitis B virus infection，OBI）特指患者血清HBsAg阴性，HBsAb、乙型肝炎核心抗体（hepatitis B core antibody，HBcAb）等阳性，可检测到低水平HBV DNA（一般＜200 IU/mL）或肝组织检测出HBsAg或乙型肝炎核心抗原（hepatitis B core antigen，HBcAg）。许多实验和临床研究均证实OBI具有传染性，可通过再激活、输血或器官移植等发展成典型的乙肝，最终发展为慢性乙肝、肝硬化和肝细胞性肝癌。OBI发生的机制还未完全清楚，HBV低水平复制、抗原表达量低、HBV基因变异、宿主免疫应答异常等均可导致OBI。最受关注的是HBV S区基因的变异，导致检测结果出现假阴性。我国是HBV的高流行国，很多学者对OBI与HBV S区基因变异的关系进行了大量研究。郭燕等[10]研究了38例OBI患者，其中8例完成了HBV Pre-S/S区基因测序；OBI毒株MHR中氨基酸的变异率显著高于野毒株，在“α”决定簇检测到I126T、Q129R、M133T、F134I、D144E和G145K突变。黄象艳等[11]研究了10例OBI慢性乙肝患者，8例患者感染的HBV存在不同S区基因的突变或突变株与野生株的混合感染；突变频率较高的位点为T47A、L98V、I/T126N/S、T131N、M133T/I等。LIAO等[12]的研究结果显示，在陕西省宝鸡地区献血者中OBI约占0.054%；对43例OBI患者的HBV Pre-S/S区基因进行分析，发现OBI毒株MHR的突变率显著高于慢性乙肝病毒株；突变位点主要见于S117T、T118K、T131N、 T134Y/L和D144E，Pre-S区还出现＞33个碱基对的缺失。

2 临床常用HBsAg检测试剂的不足

我国HBsAg的检测方法主要为酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）和化学发光免疫分析法（chemiluminescence immunoassay，CIA）。ELISA试剂盒大部分可用于血液HBsAg的筛查，检测敏感性已较高。由于检测方法主要采用双抗体夹心法，作为检测抗体和捕获抗体的HBsAb主要的结合位点是HBsAg的“α”决定簇。因此，“α”决定簇内的氨基酸置换可引起HBsAg蛋白的构象发生变化，使检测抗体或捕获抗体与变异的HBsAg结合力降低或无法识别，造成漏检。HUANG等[13]采用国内常用的检测HBsAg的4种ELISA试剂（新创、科华、万泰和Murex）和2种主流CIA（雅培和罗氏）检测7例疑似OBI的慢性乙肝患者血清，这4种ELISA试剂均为输血筛查试剂，与CIA一样，具有较高的检测敏感性。他们的研究结果显示，7份样本用新创试剂检测均为阴性，科华和万泰的试剂检测仅1份阳性，Murex试剂检测有5份样本阳性；用雅培CIA检测有3份样本阳性；用罗氏CIA检测7份样本均为阳性。由此可见，HBsAg检测试剂的敏感性和对变异抗原的识别捕获能力在检测HBsAg中非常重要。国产ELISA试剂盒与同为ELISA原理的Murex试剂相比，存在一定的差异。蓝海云等[14]使用adw、adr和ay 3种国家参考物质及真核表达的分别含G144A、Q129R/M133T、T118K/P120Q和G145R 4种变异的HBsAg作为检测样本，评价了14种HBsAg检测试剂盒（6种进口、8种国产）对野生型和突变型HBsAg的检测能力。他们的研究结果显示，对于野生型HBsAg，国产和进口试剂的检测能力无差异；对于血清型adw和adr，国产试剂的检测低限已达0.1 IU/mL；对于血清型ay，国产试剂的检测低限已达0.2 U/mL；对于Q129R/M133T突变型HBsAg，国产试剂的敏感性与进口试剂相差20倍以上；国产试剂对T118K/P120Q突变HBsAg出现漏检，且进口试剂的敏感性高于国产试剂；国产试剂和进口试剂对G145R突变HBsAg的敏感性一致。进口ELISA试剂对于突变HBsAg的检测敏感性高于进口CIA试剂；国产试剂对于突变HBsAg的检测能力需进一步提高。YANG等[15]采用10种商品化HBsAg试剂盒检测了1份来自献血者的血样，10种ELISA试剂盒中有8种检测结果为阴性，HBV DNA测序分析发现在S区出现2个天然突变位点，即nt 353A变为T和nt 349T变为A，导致氨基酸出现T118M和K122N替换；进一步分析发现是T118M的氨基酸替换造成了8种商品化ELISA试剂盒检测HBsAg的漏检；将该突变氨基酸恢复后，也恢复了这8种ELISA试剂盒的检测能力。

3 造成HBsAg漏检的可能机制和原因

目前，学者们认为导致HBsAg漏检的原因是多方面的，其中最主要的原因是HBV Pre-S/S区基因的突变。

3.1 HBV Pre-S/S区基因突变和氨基酸置换导致HBsAg的抗原性及表达降低

“α”决定簇内或临近单个或多个序列位点的变异均可引起HBsAg构象表位发生改变，从而影响抗原和抗体的结合反应[16]。S126是最常见的Pre-S/S区突变位点。现已证实T126S突变导致的氨基酸置换可明显降低HBsAg的抗原性，导致HBV出现免疫逃逸和HBsAg漏检[6]。S145位点突变的流行率为2.3%，包括G145R和G145A[6]。G145R突变是目前研究最多、报道最广泛的Pre-S/S区突变。G145R突变能改变“α”决定簇内的环状结构，使相应的抗体不能被充分识别[17]。ZHANG等[18]使用9个HBV S区基因突变载体转入真核细胞载体，转染Huh7或HepG2细胞，结果显示转染I/T126V伴G145R、氨基酸122-123位插入K-S-T-G-L-C-K短肽伴G129N突变体细胞的上清液中未检出HBsAg，转染I/T126V和Q129N伴G145R突变体的上清液中HBsAg水平显著下降；这些突变体表达的融合蛋白的抗原性仅为1.66%～63.83%，明显低于野生型。S133的突变率约为2.8%，存在3种突变类型：M133L、M133T和M133S；其中M133L仅在HBV的B基因型中被发现，M133S则存在于C基因型中，M133T突变可产生新糖基化位点T131N，新糖基化位点通过模拟B细胞表位的作用干扰HBsAg的识别[19]。有研究结果显示，G145R突变可以明显降低HBV的复制、减少HBsAg的表达，从而影响对HBsAg的检测[20]。使用定点突变技术构建G145A突变体并转染Huh7和HepG2细胞，与野生型相比较，转染G145A突变体的细胞上清液中的HBsAg水平显著降低[21-22]。ZHANG等[18]的研究结果显示，转染I/T126V突变体或I/T126V伴G145R突变体的细胞内和上清液中的HBsAg水平均明显低于野生型，而转染Q129N伴G145R突变体HBsAg水平仅中度降低。

3.2 HBV基因组Pre-S/S区突变和氨基酸置换对HBsAg分泌的影响

XIANG等[8]的研究结果显示，HBV基因组Pre-S/S区E2G、L21R、G24K、T47A/K、C69stop、L95W、L98V和G145R突变与HBsAg水平呈负相关；与野生型相比，E2G、C69stop、L95W、L98V和G145R突变使细胞外HBsAg水平显著降低，而细胞内HBsAg水平仅稍有降低；然而，突变型转染细胞的HBV总RNA和未转染前基因组RNA水平与野生型无明显差异。由此可见，Pre-S/S区突变引起的氨基酸置换未影响HBsAg转录，但HBsAg分泌受损。W172R和W182L突变型几乎可完全阻滞内质网分泌HBsAg[23]。T118K、 K141E、D144G、C147R和C149R突变可严重损伤HBV的分泌[24]。

3.3 HBV基因组可整合到宿主染色体中

HBV侵入人体后将基因组整合到宿主DNA上，约有75%以上的OBI肝细胞癌（HCC）或HBsAg阳性HCC患者在染色体DNA中发现整合的HBV DNA，其常以不完整的DNA片段整合到宿主DNA的不同位置，以HBV X基因和Pre-S/S序列为多见；这种整合破坏了HBV和宿主基因组的完整性，导致HBsAg不表达或无法被识别[25-26]。

3.4 HBsAg检测试剂的敏感性

目前，国产HBsAg试剂盒的敏感性准入标准已经达到0.5 ng/mL，进口CIA试剂已达到0.2 ng/mL。HBsAg检测的敏感性与待检样本中HBV的基因型和血清型密切相关，不同亚型间的检测敏感性可相差10倍以上[24]。尽管目前国产试剂对HBsAg的检测敏感性在不断提升，但对于Pre-S/S区突变抗原的检测能力仍需进一步提高。

4 问题与展望

HBV Pre-S/S区突变导致的HBsAg漏检对于输血安全及乙肝诊断、治疗评估等的危害性是不言而喻的。发生突变的HBV易产生免疫逃逸。易引起漏检的“热点”突变位点的发现及其病理生理机制的阐明，为改进HBsAg检测试剂的分析性能奠定了基础。目前，对于广泛报道的S145位点突变已研究得较为深入，大部分HBsAg检测试剂盒已能捕获此类型的突变株。但还应针对我国流行的HBV Pre-S/S区突变“热点”位点，如S120、S126、S129等加大力度研发检测试剂，同时提高检测的敏感性，以减少HBsAg的漏检。