异基因造血干细胞移植后急性移植物抗宿主病预防方法研究进展∗

王 方 综述,邓建川 审校

(重庆医科大学附属第二医院血液科，重庆 400010)

异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)是将健康供体的多功能造血干细胞移植到受体，是目前最有希望治愈血液系统恶性肿瘤及部分良性疾病的方法[1]。allo-HSCT主要的临床优势是供体T细胞在移植受体内能够发挥抗残留病灶的抗肿瘤效应。然而，供体T细胞介导的免疫失调会导致移植受体发生移植物抗宿主病(GVHD)，即使供体和受体的人类白细胞抗原(HLA)完全匹配，供体T细胞对移植受体仍然有很大的毒性作用。这些供体T细胞可以攻击受体的多个器官和组织，导致较高的发病率和病死率[2]。急性移植物抗宿主病(aGVHD)是allo-HSCT主要临床并发症，是一种主要引起红斑性皮疹、胃肠道症状、淤胆型肝炎的炎性疾病。

aGVHD的发生有5个阶段[3]：第1阶段涉及移植前预处理方案[化疗和(或)放疗]导致的组织损伤。预处理方案导致炎性介质释放，这些炎性介质包括肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素-1(IL-1)、黏附分子和促进增强主要组织相容性复合体(MHC)蛋白表达的危险信号，这些促炎性因子促进抗原递呈细胞(APCs)的活化成熟，以及共刺激分子和细胞因子的表达，从而促进供体T细胞的快速扩增。第2阶段涉及供体T细胞的活化。T细胞受体(TCR)和共刺激分子CD28分别与宿主APCs表面表达的相应配体相互识别和相互作用后导致T细胞活化。第3阶段，同种异体反应性T细胞扩增和分化成幼稚T细胞、效应T细胞、记忆T细胞、调节T细胞和细胞毒性T细胞(包括Th-1/Tc-1、Th2/Tc2、Th17)和其他亚群。第4阶段，趋化因子和黏附分子使活化的T细胞向GVHD靶组织(例如皮肤、消化道、肝、肺)转运，损伤的组织释放趋化因子进一步趋化其他效应白细胞(包括中性粒细胞、自然杀伤细胞、单核细胞)到GVHD靶器官中，导致GVHD的发生、发展。第5阶段，效应T细胞产生毒性细胞因子和其他免疫效应因子在受浸润受体组织中诱导细胞死亡。例如CD4+和CD8+的细胞毒性T细胞是GVHD的主要效应细胞，可以通过多种途径引起组织损伤。最近有研究表明中性粒细胞也是GVHD的影响因素，中性粒细胞通过裂解趋化因子和产生活性氧族来促进T细胞活化[4]。因此，中性粒细胞能增强预处理方案引起的组织损伤。人类肠道相关GVHD的严重程度与肠道浸润的中性粒细胞水平有关[5]。GVHD的严重程度与靶器官浸润的白细胞数量有关，主要是T细胞(CD4+)和中性粒细胞[6]。

过去几年关于预防aGVHD的方法在不断发展，本文将对近几年出现的有效预防aGVHD的方法作一介绍，以提高认识。

1 目前预防aGVHD的方法

1.1标准方法 抗代谢药(甲氨蝶呤)和钙调磷酸酶抑制剂(环孢素A或他克莫司)都能抑制异基因活化的T细胞。从20世纪80年代以来，对于接受亲缘间或无关供体的清髓性allo-HSCT的受体，甲氨蝶呤与钙调磷酸酶抑制剂联合使用一直作为预防GVHD的标准方法[7]。霉酚酸酯(MMF)的代谢产物霉酚酸可以抑制鸟嘌呤核苷酸的合成，从而抑制淋巴细胞的增殖，与钙调磷酸酶抑制剂在预防aGVHD方面具有协同作用。目前，在非清髓性的异基因造血干细胞移植中，MMF通常与钙调磷酸酶抑制剂联合用于预防GVHD[7]。

2 新颖的预防aGVHD的方法

2.1体内去除T细胞

2.1.1抗胸腺细胞球蛋白(ATG) ATG是用人类胸腺淋巴细胞或Jurkat细胞株免疫马或兔子而获得的多克隆IgG抗体，ATG包含有针对T细胞表达抗原(例如CD2、CD3、CD4、CD7、CD8)的抗体，可以通过补体依赖性溶解和细胞相关凋亡等细胞死亡途径来诱导体内T细胞耗竭，可通过诱导STAT5途径来诱导调节性T细胞的增殖，其中兔源ATG经常用于预防GVHD。Karolinska大学的研究人员进行了一项回顾性研究，110例入组病例在非清髓性预处理后给予非亲缘的外周血造血干细胞移植(PBSC，n=95)或骨髓移植(BM，n=15)，比较ATG总剂量为6 mg/kg(n=66)和8 mg/kg(n=44)的差异，结果显示高剂量ATG组有较低的无白血病生存率(P=0.04)[8]。比利时血液学会进行的一项研究报道将TLI-ATG方案(ATG总剂量1.5 mg/kg，-11～-7 d)与氟达拉滨联合2 Gy全身照射的低强度方案相比较，结果显示两组的总生存率相似(54%vs. 53%)，TLI-ATG组中/重度慢性移植物抗宿主病(cGVHD)的发生率显著降低(18%vs.41%，P=0.02)，但TLI-ATG组4年复发或进展的风险较高(50%vs. 22%，P=0.02)[9]。最近报道了一项关于非血缘allo-HSCT的Ⅲ期随机研究，其中99例患者为ATG组(0.5 mg/kg，-2 d和2 mg/kg，-1 d和+1 d)和97例为无ATG组，67%的患者接受了清髓性预处理，88%的患者接受亲缘间外周造血干细胞移植(PBSC)，结果显示ATG组Ⅱ～Ⅳ级aGVHD发生率明显降低(50%vs.65%，P=0.01)且没有增加复发的风险(11%vs.16%，1年)，然而ATG组有较高的EBV病毒活化发病率(33%vs.3%)[10]。KROEGER等[11]报道了另一项PBSC的Ⅲ期随机研究，155例患者随机分为ATG组(n=83，10 mg·kg-1·d-1，-3,-2和-1 d)和无ATG组(n=72)，结果显示cGVHD的2年累积发病率降低(32%vs.69%，P<0.05)，而其他移植结果(白细胞和血小板植入、感染、aGVHD、非复发死亡率、复发率、总生存率、无进展生存期)两组间差异无统计学意义(P>0.05)。

2.1.2阿伦单抗 阿伦单抗是一种人源化单克隆抗体，可以识别各种白细胞(包括淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞和一些树突状细胞)表面的CD52，与CD52受体结合通过补体结合和抗体依赖的细胞介导的细胞毒性机制导致体内T细胞和B细胞耗竭。阿伦单抗可以降低亲缘间或无关供者移植受体的GVHD发生风险，但移植后阿伦单抗在血液中可持续存在1～2个月，这将会导致免疫重建的延迟，从而引发病毒性感染和疾病复发[12]。RESENDE等[13]进行的前瞻性队列研究(共57例病患)，其中23例移植前接受阿伦单抗(儿童 1 mg/kg、成人 30 mg/d)治疗，结果显示移植后100 d阿伦单抗治疗组中只有4例发生了Ⅱ～Ⅳ级aGVHD，而未接受阿伦单抗治疗组中移植后100 d Ⅱ～Ⅳ级aGVHD发生率为29%，但是阿伦单抗会增加巨细胞病毒激活的风险且没有提高生存率。

2.1.3喷他司丁 喷他司丁是一种嘌呤类似物，通过抑制腺苷脱氨酶使脱氧腺苷三磷酸累积产生的细胞毒性作用来诱导体内淋巴细胞耗竭。由于T细胞内腺苷脱氨酶的酶活性大于B细胞，因此喷他司丁主要诱导供者T细胞耗竭且抑制骨髓的风险低。PARMAR等[14]进行的控制剂量研究中，对于接受HLA不匹配相关或无关供体移植的受体采用随机给予不同剂量的喷他司丁(0.0、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/m2)治疗，结果表明接受喷他司丁/他克莫司/甲氨蝶呤治疗的患者组中，Ⅱ～Ⅳ级GVHD的发病率明显低于他克莫司/甲氨蝶呤组，其中接受1.0 mg/m2和1.5 mg/m2剂量的喷他司丁组的GVHD发生率最低。

2.1.4环磷酰胺(Cy) Cy是一种氮芥烷化剂，与DNA发生交叉联结抑制DNA合成，能够迅速杀死增殖细胞。在移植后早期给予Cy可以抑制异体反应性供者T细胞克隆，同时保留静息T细胞和造血干细胞以及调节性T细胞(Treg)。RAIOLA等[15]报道接受清髓性半相合骨髓移植后的患者采用Cy(50 mg/kg，+3、+5 d)联合环孢素A(1 mg/kg，0～+20 d)或Cy(50 mg/kg，+3、+5 d)联合吗替麦考酚酯(15 mg/kg，+1～+28 d)预防GVHD，结果显示Ⅱ～Ⅳ级aGVHD的发生率为24%，Ⅲ～Ⅳ级aGVHD的发生率为10%。有研究报道，采用跟上述一致的方案预防GVHD时，HLA不匹配的程度可以不作为选择家庭半相合供体的标准[16]。

2.1.5细胞自杀基因疗法 细胞自杀基因疗法是另一种很有前途的方法，能够调节供者T细胞的功能以增强移植物抗白血病(GVL)效应及促进免疫重建，并防止GVHD[17]。单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)已经广泛地被作为人类自杀基因，可以催化三磷酸丙苷的产生，从而抑制DNA链延伸，对增殖细胞有毒性作用。在输注供体淋巴细胞前，利用反转录病毒将HSV-TK转移到供者T细胞可以有效控制供者T细胞的异体反应。自杀基因修饰的供者T细胞对于接受移植的受体来说，可以有效地抗白血病、抗病毒并且能促进免疫重建。目前，已经有Ⅲ期临床试验来评估单纯疱疹病毒疗法对高风险急性白血病患者移植后GVHD的预防作用[17]。但HSV-TK有潜在的免疫源性，因此一直在探索可替代的自杀基因策略，如诱导人类半胱天冬酶9转基因(iC9)。

2.2阻断信号通路

2.2.1硼替佐米 硼替佐米是一种蛋白酶体抑制剂，通过抑制NF-κB、P44/42丝裂原活化蛋白激酶通路，从而减少T细胞的活化、增殖同时增加异体反应性T细胞的凋亡。此外，硼替佐米可抑制活化T细胞中白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-10的释放，抑制抗原递呈细胞(APC)的功能和促进Treg增殖[18]。LI等[19]研究硼替佐米在不同时间点和不同剂量下对小鼠GVHD模型的影响是否有差异，研究结果表明：硼替佐米预防aGVHD的有效性取决于硼替佐米给药的时间和频率，在移植后0和+1 d静脉输注2个剂量硼替佐米(每剂量1 mg/kg)能够最大获益，能够使IL-2、IFN-γ和TNF-α等细胞因子的血清水平在移植后+7 d显著降低，在移植后+3 d和+4 d减少供体T细胞的扩增，以及在移植后+7 d增强CD4+T细胞在脾脏中分化成Th17亚型，在移植后0 d和+1 d静脉输注2个剂量硼替佐米显著提高生存率，减轻aGVHD的临床症状(例如皮肤病变、弯腰驼背、体质量减轻、腹泻)且不改变免疫重建，将硼替佐米给药时间延迟到移植后+2 d，GVHD相关的病死率显著增加。

2.2.2CTLA4-Ig 共刺激分子是异体反应性供者T细胞活化的第二信号，CTLA4-Ig(阿巴西普、贝拉西普)是由CTLA4的胞外结构域和人IgG1的Fc片段组成的重组蛋白。CTLA4-Ig与APC表面的B7结合，使之不能与T细胞表面的CD28相互作用。 KOURA等[20]研究接受无关供体造血干细胞移植(HCT)期间通过体内阻断CD28:CD80/86共刺激通路来预防aGVHD的有效性，在移植后(-1、+5、+14、+28 d)接受环孢素和甲氨蝶呤以及4个剂量的阿巴西普(每个剂量10 mg/kg)的方案患者组中，只有2/10的患者发生了Ⅱ～Ⅳ级aGVHD,但是7/10的患者感染了巨细胞病毒或EB病毒，和同期未接受阿巴西普组相比，接受阿巴西普组中CD4+T细胞的早期活化和增殖显著被抑制，主要机制可能是影响效应记忆(TEM)亚群，减少CD4+效应记忆细胞的增殖和活化，所有这些表明阻断共刺激通路是接受无关供体造血干细胞移植患者aGVHD标准免疫预防的重要辅助手段。其他方法还包括：阻断CD137、可诱导的共刺激物(ICOS)、PD-1、CD40和CD40配体(CD40-L)通路。但以上方法目前仍只是在实验室动物模型阶段，其安全性和有效性仍需更进一步的大量研究。

2.2.3西罗莫司 西罗莫司(雷帕霉素)与细胞内蛋白FKBP12结合，抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路，从而阻断IL-2介导的信号转导，导致幼稚T细胞的细胞周期阻滞。此外，西罗莫司可抑制抗原呈递细胞、胸腺，对移植后Treg亚群有保护作用。一项Ⅱ期随机研究将西罗莫司联合他克莫司预防aGVHD的效果与甲氨蝶呤联合他克莫司相比较，结果显示移植后100 d西罗莫司/他克莫司组Ⅱ～Ⅳ级aGVHD的发生率显著降低(43%vs.89%，P<0.05)，两组之间的总生存率和患者报告的生活质量没有明显差别。移植后第30天和第90天，西罗莫司治疗的患者外周血CD4+细胞中Treg比例显著增加，且Treg功能增强[21]。最近，在接受亲缘间造血干细胞移植的患者中进行的Ⅲ期多中心试验也比较了以上两种方案，发现两种方案无Ⅱ～Ⅳ级aGVHD的生存率差异无统计学意义(67%vs.62%，P=0.38)，且Ⅱ～Ⅳ级aGVHD发病率也相似(26%vs.34%，P=0.48)，但西罗莫司/他克莫司组的中性粒细胞和血小板植入时间更短(14 dvs. 16 d，P<0.05，16 dvs. 19 d，P=0.03)，且具有更少的黏膜毒性的优点，但西罗莫司/他克莫司组的内皮损伤综合征有所增加，特别是预处理中包含有白消安方案的患者[22]。

2.2.4抑制相关信号通路 TLR9和STAT3信号通路对APC的成熟和T细胞的活化至关重要。SAT05f和nifuroxazide为以上两个关键信号通路的抑制剂。研究表明，联合SAT05f和nifuroxazide治疗显著降低aGVHD的严重程度且延长生存率，此外SAT05f和nifuroxazide联合治疗将减少CD4细胞的活化，增加Treg细胞数量，抑制细胞因子的释放[23]。

2.3Treg Treg是免疫反应的关键调节因子，胸腺细胞衍生的Treg表达FoxP3转录因子，CD4+CD25+Treg是自身免疫耐受的重要调节因子，在机体对异型抗原产生免疫耐受中至关重要。Treg可减少移植排斥反应，降低GVHD的发生率和严重程度。Treg能够抑制异体反应性供者T细胞的早期扩增，在限制GVHD的发生、发展的同时保持GVL效应。 BRUNSTEIN等[24]设计的研究用于评估在体外用KT64/86(CD28的天然配体)刺激脐带血扩增衍生的Treg安全性和最大耐受剂量，计划的剂量水平分别是3、10、30、100、300×109/kg，结果显示接受3×109/kg剂量患者的Ⅱ～Ⅳ级aGVHD的发生率与对照组(西罗莫司/MMF)相比显著降低(43%vs.61%)，在所有患者中aGVHD的100 d累积发生率为9%，而对照组为45%，接受Treg治疗组虽然与对照组有相似的感染率，但具有更快的CD4和幼稚CD4+T细胞复原。

2.4调节表观遗传学 组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂能改变基因转录和表达，以及减少炎症因子的产生。伏立诺他是一种组蛋白脱乙酰基酶抑制剂，在非细胞毒性低浓度的情况下，可以通过诱导吲哚胺2,3-双加氧酶调节APC以及Treg功能，保留GVL效应。CHOI等[25]评估了非清髓性方案中接受相关供体的造血干细胞移植的受体使用伏立诺他预防GVHD的效果，给予方案为他克莫司(0.03 mg·kg-1·d-1，直至8～12 ng/mL的目标水平，-3～180 d)联合霉酚酸酯(1 g，3次/天，0～28 d)以及伏立诺他(100 mg或200 mg，2次/天，-10～100 d)，结果显示100 d Ⅱ～Ⅳ级aGVHD的发生率为22%。

2.5阻断JAK1/JAK2 IFNγR在活化的T细胞中表达，对T细胞转运到GVHD靶器官至关重要，接受IFNγR-/-供者T细胞的受体中GVHD的发生显著减少同时保留GVL效应[26]。IFNγR信号是由JAK1和JAK2介导的，阻断JAK1/JAK2可减少GVHD发生且同时保留移植物抗白血病效应。芦可替尼 (INCB018424)是市售的强效JAK1/JAK2抑制剂。有研究表明，INCB018424降低两种(淋巴白血病和髓系白血病)小鼠模型allo-HSCT后GVHD发病率同时保留了移植物抗白血病效应，此外allo-HSCT后长期服用芦可替尼提高了生存率且优于其他JAK1/JAK2抑制剂，如TG101348或AZD1480。国外有研究报道临床用芦可替尼作为激素难治性急性或慢性GVHD的补充性治疗，今后能否用于预防，值得探索。

2.6抑制趋化因子和细胞因子受体 达利珠单抗是一种人源化的IgG1单克隆抗体，巴利昔单抗是一种嵌合单克隆抗体。两者结合IL-2受体的α亚基或CD25来选择性抑制T细胞活化。最近的一项回顾性分析表明，接受无关供体移植的患者接受巴利昔单抗或达利珠单抗联合标准的GVHD预防方案可以减少aGVHD发生率且增加2年生存率。

3 小 结

首先，最近20年出现了许多预防aGVHD的方法来改善allo-HSCT后患者的预后，耗竭供体T细胞的策略被证明能够有效预防aGVHD，此后耗竭T细胞的策略方法不断涌现，甚至有专门针对活化的同种反应性T细胞。但目前大多数策略在减缓GVHD的同时也减少了可以对抗患者体内残留病灶的抗肿瘤效应。寻求可以防止GVHD发生、发展又可以保持甚至增加移植物抗肿瘤效应的更安全的方法，能够对高风险移植患者有极大的帮助。因此，在耗竭T细胞的异基因移植后提高免疫重建和移植物抗肿瘤效应将是未来GVHD预防方法的基本模式。其次，目前一些有希望预防aGVHD的策略(例如JAKs抑制剂)也只是处于实验室阶段，还没有Ⅱ期的研究评估其安全性和有效性。因此能否真正应用于临床，还需要进一步的大量研究。此外，Treg预防aGVHD的方法也面临着挑战，例如Treg的数量以及保证注入细胞在宿主体内保持免疫调节性。最后，未来对aGVHD的发病机制的新认识可能是促进预防aGVHD的新方法的诞生。从与aGVHD的病理生理有关的细胞因子、细胞内信号通路、表观遗传学和免疫调节等方面着手，将是一个预防aGVHD而又不影响移植物抗肿瘤效应的好方法。