肥厚型心肌病的基因治疗研究进展

蒋显超 综述 王强 审校

(北京协和医学院 中国医学科学院 国家心血管病中心 阜外医院小儿心脏外科，北京 100037)

肥厚型心肌病(hypertrophic cardiomyopathy,HCM)是导致猝死、心力衰竭及心房颤动(合并脑栓塞性卒中)的重要原因之一[1-3]。HCM全球发病率超过0.2%，意味着全球患者总数达1 200万[4]。目前HCM治疗是基于症状改善的药物及非药物治疗：其中药物治疗包括β受体阻滞剂、非二氢砒啶类钙离子通道阻滞剂等，而非药物治疗主要包括室间隔消融治疗及室间隔肥厚技术切除手术(Morrow手术)等；但上述治疗不能抑制心肌肥厚的进展，患者最终发展为难治性心力衰竭。近年来，随着HCM分子生物学机制研究的不断深入及心肌特异性病毒载体的发现，基因治疗作为一种新思路逐渐出现在人们的视野。

1 HCM遗传学基础

HCM是一种单基因常染色体显性遗传性疾病[5]。HCM心肌肥厚是由于编码肌节蛋白的基因突变，导致心肌收缩装置钙离子敏感性增高或心肌细胞压力增加而诱发的一种“代偿性”表现[6]。目前研究显示，发生于11个编码肌节或者相邻Z盘之间区域粗、细肌丝收缩蛋白基因的约1 400个突变与HCM发病相关。其中70%的基因突变发生于β肌球蛋白重链(其编码基因名称MYH7)及肌球蛋白结合蛋白C[cardiac myosin-binding protein C，cMyBP-C(其编码基因名称MYBPC3)]，而肌钙蛋白T(其编码基因名称TNNT2)和其他几种相对少见基因突变各占5%[5,7]。

2 HCM基因治疗

基因治疗的理论基础主要包括三个方面：(1)替换、弥补异常基因或致病通路蛋白；(2)增强或抑制某些特定基因的表达；(3)剪接致病基因片段，恢复正常蛋白表达。

合理的心脏基因靶向治疗包括合适载体的选择、目的基因构建和器官靶向的载体运输系统。其中载体通常为病毒，能将目的基因带入靶细胞中；目的基因是治疗的主要成分。而基因的靶向运载可通过心肌注射和冠状动脉内灌注实现。目前采用心脏特异启动子构建目的基因，可最大限度降低治疗副作用，减少非靶器官内基因表达等不良后果。

2.1 病毒载体的选择

从20世纪90年代初开始研究将基因转移到心肌细胞。初始策略是直接心肌注射裸DNA质粒，但目的基因仅可在特定区域表达1～2个月[8]，无法达到长期稳定的表达，而心肌特异性病毒载体的发现和应用成功解决了上述难题。目前常用的病毒载体包括：慢病毒、腺病毒、腺相关病毒(adeno-associated viruses,AAVs)。慢病毒具备强大的心肌细胞转导能力，诱发免疫原性反应极低，改良的慢病毒可进一步避免宿主基因组插入突变的风险，目前已尝试用于治疗多种人类疾病的治疗[9-12]。腺病毒的基因包装能力强大，但其在宿主细胞中表达时限短，且可诱发强烈的免疫和炎症反应，在临床试验运用较少。而AAVs能在心肌细胞中长期稳定表达，诱发免疫原性反应弱；对AAVs载体进行基因修饰，让其无法整合到宿主细胞基因组中，确保其可在宿主细胞中维持数年，并持续稳定表达[13]。

2.2 基因治疗的分子生物学技术

2.2.1 基因置换

基因置换是通过输入治疗基因并促进其表达来弥补或替换缺失和无功能蛋白。肌质网蛋白、心肌肌质网 Ca2+-ATP酶2a(sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase 2a,Serca2a)及受磷蛋白(PLB)在肌质网钙离子再摄取中起到重要作用，Serca2a/PLB比值降低可影响肌质网钙泵的活性，这些对于维持心肌正常的舒张功能起到重要作用。Jagatheesan等[14]将原肌球蛋白基因突变的HCM小鼠，与编码嵌合蛋白小鼠杂交发现，通过修复收缩蛋白，改变钙敏感性可以阻止心肌肥厚的病理生理进程。随后，Pea等[15]的研究指出，绝大多数由细肌丝蛋白突变所致的HCM都存在肌丝蛋白对钙离子敏感性增加及舒张功能紊乱的特点，导致压力敏感所致心肌肥厚的通路激活。通过病毒载体进行Serca2a基因转移，可上调Serca2a基因表达，改善Serca2a/PLB比值，进而改善心肌细胞的舒张功能，延缓心肌肥厚和心肌纤维化。

心肌肌节横桥动力学异常可导致心肌细胞压力负荷增加，同样可激活心肌肥厚通路。MYBPC3基因突变可导致cMyBP-C表达，使横桥动力学表现异常，产生严重的心肌收缩功能障碍，导致HCM发生。Merkulov等[16]通过特异性慢病毒载体进行基因转移，增加HCM小鼠MYBPC3基因表达水平，改善横桥异常动力学，改善心肌收缩功能，进而延缓或逆转心肌肥厚及心肌纤维化病理进程。近日,Prondzynski等[17]将全长MYBPC3 cDNA导入由MYBPC3基因突变所致HCM患者多功能干细胞诱导分化而来的异常心肌细胞，提高cMyBP-C表达水平，也成功抑制心肌肥厚。

2.2.2 基因沉默

基因沉默是通过RNA干扰技术，降低突变蛋白表达，以达到治疗效果。可用于显性负性效应所致功能获得型或缺失型突变或蛋白高表达所致的获得性疾病中。研究人员发现，一些RNA抑制剂(微小RNA或非编码RNA)可特异性抑制mRNA翻译、促进mRNA降解。Jiang等[18]将特异性的RNA抑制剂通过病毒载体AAV9(AAV-9-cTnT-EGFP-RNAi)导入刚出生的MYH6基因突变所致的HCM动物模型中，可延缓HCM临床表型。近年来，Klattenhoff等[19]发现一种新型长非编码RNA(Braveheart,Bvht)，这种RNA对于新生中胚层发育成为心脏至关重要，并且Bvht也是核心心血管基因网络激活，以及一种称为中胚层后蛋白(mesoderm posterior 1，MesP1)下游功能所必需的元件，MesP1是常见多能心血管祖细胞的主要调控因子。随后，Han等[20]发现染色质重塑蛋白(Brg1)可调节心肌发育、分化及基因表达，其作用在成年时终止。若Brg1被压力负荷激活，可导致心肌肥厚的发生，激活水平与疾病严重性及肌球蛋白重链转变相关。该研究团队发现一批长链非编码RNA(lncRNA)，通过拮抗Brg1的作用，阻碍病理性心肌肥厚。正常成年心脏中肌球蛋白重链基因(MYH7)可通过心脏特异性反义转录，剪切产生一批丰富的lncRNA分子，称作MyHEART or Mhrt(Myosin Heavy Chain Associated RNA Transcripts)；Mhrt可拮抗Brg1对染色质的作用。同时，在心脏受到致病刺激时，被激活的Brg1会与某些蛋白组成Brg1-Hdac-Parp复合体，该复合体会与Mhrt的启动子结合，抑制Mhrt转录。Mhrt对Brg1的抑制以及Brg1-Hdac-Parp复合体同Mhrt启动子的结合，组成一个完整的心脏保护性的反馈回路[20]。在Mhrt研究的基础上，Yang等[21]通过微阵列分析，找出了一系列与HCM相关的lncRNAs，极大地丰富了HCM相关的lncRNAs谱，促进了基因沉默技术的发展。

2.2.3 外显子跳跃

外显子缺失是基因编码区突变导致疾病发生的主要原因，如能将外显子重新恢复到基因转录本中，将会给许多疾病的治疗带来曙光。Gedicke-Hornung等[22]通过外显子跳跃治疗技术，利用特异性病毒载体将介导外显子跳跃的反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide，AON)转导至新生小鼠的心肌细胞，成功抑制了MYBPC3基因突变所致异常转录mRNA的表达，增加了缺失外显子的表达，也成功抑制了心肌肥厚的进展。

2.2.4 反式剪接

反式剪接通过将两条不同pre-mRNA的外显子连接，使mRNA发生嵌合修复，进而转录成正常蛋白。反式剪切介导的基因治疗已用于多项研究中[23-25]。近期,Prondzynski等[17]证明反式剪接在由MYBPC3基因突变所致HCM患者多功能干细胞诱导分化而来的肥厚的心肌细胞中可实现；但由于剪接效能低，治疗效果不明显。在MYBPC3基因突变的HCM模型中，通过PTMs(pre-trans-splicing molecule)可实现整条MYBPC3 mRNA任意位点突变的修复；故理论上说，可治愈40%～60%的HCM患者[26-27]。此外，与AON介导的外显子跳跃不同，反式剪接可实现cMyBP-C蛋白全长及功能性修复，修复更容易且迅速。

2.3 器官靶向的载体运输系统

基因转导主要由载体的靶向性决定，但基因递送技术也起关键作用。应用最广泛的方法是心肌注射和冠状动脉内灌注，二者各有优劣，目前尚未达成共识。

心肌内注射是以导管为基础的微创手术方法，可将携带目的基因的病毒直接注射到组织中，提高载体的局部浓度。目前使用这种方法难以实现载体区域均匀扩散，给药后转染的细胞比例也无法达到治疗效果。而冠状动脉内灌注通过冠状动脉插管实现，可将携带目的基因的载体传递至整个心脏。然而，由于冠状循环速度快，载体的注射效能可能会降低。目前，该方法已在CUPID试验中成功应用，因此其安全性已在人类中得到验证[28-31]。

2.4 基因治疗的局限性

HCM基因治疗研究的不断深入，将面临更多的挑战：在基因转移技术中，如何严格控制载入目的基因的效应，减少毒副作用或外源性蛋白过度表达；在基因沉默技术中，如何抑制目标蛋白表达的过度降低；同时未来需要找到更加专一的心脏靶向病毒，减少其他组织对“脱靶”病毒载体的摄取；需要意识到错误摄取可能会损害其他组织细胞功能及病毒载体的植入可导致潜在插入突变事件。另外，多数研究结果均未在更高级的哺乳动物中进一步证实，每次需注射的病毒剂量、剂量-效应关系、再次注射的时间间隔需要进一步探索。多数研究显示，只有对出生1 d的动物进行基因治疗，才能有效地抑制或延缓HCM进程，目前仍缺乏临床前期HCM的线索，早期诊断、干预困难重重；一些抑制效应亦会随时间推移逐渐消失，且不能逆转已肥厚的心肌。

3 基因治疗的临床初期实践

Serca2可控制肌质网与细胞质间钙离子流动，对调节心肌舒张有重要作用；重症心力衰竭肌质网活性调节蛋白的缺乏，是心脏进行性收缩和舒张功能衰竭的重要机制。CUPID研究是第一个将基因转移技术用于人类治疗的临床研究。研究中，人们利用经皮冠状动脉治疗装置将携带有肌质网活性调节蛋白基因(Serca2 cDNA)的腺病毒1(AAV1)植入重症心力衰竭患者心脏中。

在开放标签的CUPIDⅠ期研究中，9例心力衰竭患者接受AAV1-Serca2治疗；9例患者共分3组，每组3人，分别给予低、中、高剂量病毒。其中1例中等剂量患者死亡，死亡原因与病毒无关，余下8例患者无不良反应。6例患者心力衰竭症状、左室功能、N 末端脑钠肽有所改善；余下2例患者体内存在病毒抗体，对治疗无反应[28]。CUPIDⅡ期双盲安慰剂对照研究共纳入39例心力衰竭患者。相比安慰剂组，高剂量组在12个月时，心血管事件发生率(HR=0.12，P=0.003)及住院时间(0.4 d vs 4.5 d，P=0.05)显著下降[29]。3年后，这项研究显示出了安全性和有效性：试验组存活患者(7/25)的比例多于安慰剂组(6/14)，尤其在高剂量组(1/9)；与安慰剂组相比，高剂量组心血管事件下降了82%(P=0.048)；对3例高剂量组患者进行心肌细胞活检，证实了治疗基因的存在[30]；但是在纳入更多受试者的CUPIDⅡb期多中心随机双盲对照研究中，应用相同治疗方法，进行为期1年的随访发现，未能改善心力衰竭患者临床进程及射血分数，最终宣告失败[31]。然而，该研究为未来治疗心脏疾病提供了一个新思路；同时也证实，在人体中，利用特异性病毒载体进行基因治疗是安全可行的。

综上，发现与该治疗相关的靶基因Serca2a亦是心肌肥厚下游通路相关基因之一，是否能通过此方式设计新基因药物改善HCM患者心肌肥厚进程值得研究；有效的病毒治疗剂量仍需继续探索；对于有家族史的患者，早期干预是否能更大程度地改善患者预后，这一科学问题也值得进一步探究。

4 总结与启示

前述基因治疗最新研究成果指明单基因突变所致的HCM基因精准化治疗的广阔前景和新的希望。同时发现，目前对HCM基因治疗都是以动物模型为基础，缺乏大型哺乳动物相关研究；基因治疗总原理是“对因治疗”，即“缺什么，补什么；表达过度，施行抑制”的原则。事实上，临床上大多数患者基因突变情况并不明确，且进行大规模的突变基因筛查十分不现实。所以，可从更加实际的角度出发，避开寻找海量突变基因，将上述研究的理论依据运用于临床。通过上述的研究成果，可对流出道梗阻型先天性心脏病患儿(如法洛四联症、HCM等)进行相关主要“高表达或低表达”基因或蛋白筛查，依据“缺什么，补什么；表达过度，施行抑制”的治疗原则，对相关主要基因进行靶向调节，延缓心肌肥厚程度，改善梗阻症状，使患者存活较长时间后，再行手术治疗，以降低手术难度和风险，改善患儿预后，并达到预防术后复发的目的。

HCM基因治疗的研究成果，为今后HCM的基因靶向精准治疗提供了大量的科学依据，同时也为临床治疗肥厚梗阻型先天性心脏病提供了新的治疗理念与思路。同时，最新HCM调控蛋白Brg1与心肌保护序列Mhrt基因的发现，也为今后探索HCM早期识别的生化标志物、治疗新靶点及设计相应靶点药物指明方向。

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