骨髓间充质干细胞在骨髓增生异常综合征中的研究进展

庞艳彬，范丽霞，罗建民，杜 欣

(1.河北大学附属医院 血液内科， 河北 保定 071000； 2.河北医科大学第二医院 血液内科， 河北 石家庄 050000；3.广东省人民医院/广东省医学科学院 华南理工大学医学院 血液内科， 广东 广州 510080)

骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome,MDS)是一组异质性肿瘤性疾病，以骨髓无效造血并伴有向急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)转化的风险为特点[1- 2]。尽管近些年对MDS造血细胞中的遗传学和分子学认识取得长足进展，针对造血细胞的新药如阿扎胞苷和地西他滨能够延缓MDS向AML的转化、延长患者总生存期[3]，然而即使产生治疗反应的患者大部分终将在2年内因疾病进展而死亡[4]，说明还有其他因素参与了疾病的进展。

骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是骨髓微环境的关键成分[5]。MSCs具有自我更新和多向分化潜能，能够分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞等多种细胞，精细调控造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)以使其保持终生造血的能力[6]。此外，MSCs还具有免疫调节功能，在维持骨髓微环境的免疫稳定方面也具有重要的作用[7]。虽然动物实验表明MSCs中的基因异常足以诱导骨髓出现MDS表现[8]，并且功能异常的MSCs有助于MDS疾病的进展和AML转化[1,7,9- 10]。但是，关于MDS来源的MSCs(MDS-MSCs)的遗传学、表观遗传学、分化潜能及其在MDS进展中的作用仍然知之甚少，部分结果甚至存在矛盾[11]。因此，有必要对MDS患者MSCs的功能特点及其在疾病进展中的作用做一总结，加深对MDS发病机制关键步骤的理解有助于产生新的治疗方法。

1 骨髓微环境对正常造血调控具有决定性作用

造血是HSC根据机体不同状态的需求有序产生所有成熟血细胞的过程[6]。HSC需保持自我更新的能力，以终生维持造血的稳定。但HSC具有自我更新能力并不能充分保证终生维持正常造血，因为损伤事件在HSC中累积最终可能导致骨髓造血衰竭或白血病样的造血[12]，因此，HSC需要一个保护性的局部微环境，即造血干细胞龛(niche)。出生后造血干细胞龛主要存在于骨髓腔中[5]。使HSC保持相对静止的状态，这有利于降低外界对HSC造成的损伤，从而保持长期稳定造血[12]。

造血干细胞龛由交感神经细胞、间质细胞、血细胞和免疫细胞等多种细胞构成[6- 7]。细胞间通过细胞表面基质、细胞因子等多种成分相互协调与参与调控细胞增殖、分化有关的细胞内信号通路共同对HSC的调控，其中，细胞外信号在对HSC的调控过程发挥了决定性的作用[7,12]。

2 MSCs是造血微环境的关键成分之一

早期的动物实验表明成骨细胞功能变化与HSC数量密切相关[13]。通过对成骨细胞进行基因加工使其活化后分泌Jagged- 1的能力明显增加。Jagged- 1与HSC上相应受体结合后引起HSC内Notch信号通路活化，导致HSC数量增加，而抑制HSC中Notch信号通路活化则使HSC数量减少。该结果表明成骨细胞似乎是HSC龛重要成分。

然而早期的实验结果是建立在对成骨细胞进行基因加工的基础之上。但是造血调控需要造血干细胞龛内的多种细胞之间相互协调共同完成，通过基因调控干预成骨细胞的功能，同时也可能对微环境中其他细胞的功能产生了影响[5]。此外，近期的研究结果充分说明基因调控后的成骨细胞对HSC的数量的影响只反映成骨细胞对HSC的间接作用，并非直接作用[14- 15]。移植后更多归巢的HSC位于血管周围，说明血管周围含有参与调控HSC行为的成分[12]。

间充质干细胞(MSCs)在整个骨髓中主要分布于血管周围[7]，MSCs具有自我更新和多向分化潜能，可分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞等多种间质细胞[11,16]。MSCs及其衍生细胞含有参与调控造血的基因，在HSC的增殖、分化、归巢过程中发挥了重要的作用[5- 7]。此外，血管周围的MSCs和交感神经形成了缝隙连接复合体，在交感神经的支配下，MSCs有节律的、脉冲性释放CXCL- 12调节HSC动员的昼夜节律。删除血管周围MSCs直接导致骨髓中HSC的丢失[7]，因此MSCs是造血干细胞龛的重要成分。

3 MDS的肿瘤细胞受骨髓微环境调控

MDS是克隆性肿瘤性疾病的概念已被广泛接受，MDS中的肿瘤细胞是获得了遗传学和/或表观遗传学事件后发生了转化的正常HSC[1,3]。MDS中的肿瘤细胞是异质性细胞，不仅不同个体间细胞中的遗传学存在差异，即使是同一患者的肿瘤细胞在启动疾病形成的能力方面也不同[3,9,17]。

在原位异种移植试验中，将MDS患者的肿瘤细胞移植给免疫缺陷的NSGS小鼠[9]：移植后的小鼠具有与MDS患者相似的临床特点；移植的 MDS肿瘤细胞启动MDS形成和传播的能力存在差异：只有Lin-CD34+CD38-表型的细胞才能启动疾病的形成，且该细胞具有多向分化潜能和克隆形成能力，在连续的移植实验中保持重建造血能力。因此，MDS的肿瘤细胞具有正常HSC的自我更新和多向分化的特性。同样受到骨髓微环境的调控[1]。

4 MDS来源的MSCs与正常的MSCs之间存在明显差异

动物实验中MSCs本身基因改变可导致MDS的发生[8]，说明MSCs异常在MDS形成中可能具有重要作用。MDS来源的MSCs(MDS-MSCs)在体外培养后进行染色体核型分析，高达55.5%的MDS-MSCs存在染色体结构异常[7]，以染色体的获得或缺失多见，平衡易位少见。MDS-MSCs中的染色体异常与造血细胞中的情况并不相同[18- 19]，但与患者的临床特点密切相关：MSCs中存在核型异常的患者造血细胞中多存在复杂核型；MSCs中存在异常核型的患者总生存期和无病生存期较短[19]。但是也有研究认为MDS-MSCs本身并不存在染色体结构异常[20]，其存在的染色体异常为体外培养过程中非特异性损伤造成。不同实验产生差异可能与多种因素有关：目前尚无统一的检测标准对MSCs中染色体进行分析；MSCs的体外分离、纯化、培养体系、待测样本的传代次数等都可能对结果产生影响[7]。但是，MDS-MSCs易于出现染色体结构异常的结果至少说明MDS-MSCs中染色体结构不稳定[7]。

MDS-MSCs 的染色体结构不稳定说明细胞存在衰老的现象，该现象可与染色体的异常甲基化有关[6]。使用450 Infinium甲基化数据高通量分析(infinium methylation 450 K arrays)MDS-MSCs的甲基化状态，发现参与成骨分化的的基因中存在高度甲基化现象，导致调控早期成骨分化的转录因子Osterix表达明显下降[11]。成骨分化的早期转录因子表达下降的MSCs移植到小鼠肾被膜下将不能形成适合HSC生长的骨髓腔样结构[21]。此外，参与成骨分化的基因表达下降以及体外诱导分化的MDS-MSCs化学染色表明其成骨分化潜能明显下降[11,18]。说明MDS-MSCs的异常甲基化导致相关基因表达下降和成骨分化潜能下降。

MDS-MSCs中遗传学和表观遗传学异常以及调控成骨分化的转录因子表达下降，说明MDS-MSCs存在功能衰竭的现象。这也得到动物实验结果的支持：在MDS的小鼠中，虽然骨髓微环境中的MSCs和成骨细胞数量增加，但功能性的MSCs并没有增加，作为MSCs子细胞的成骨细胞合成和分泌具有骨骼形成和造血调控作用的osteocalcin无明显升高，说明MDS骨髓微环境中的MSCs和成骨细胞功能衰竭。

MDS来源的MSCs的功能衰竭还表现在多种分子表达异常，如Jagged- 1、CXCL- 12(SDF- 1)、IL- 6、TGF-β、SCF、VEGF和IDO等[6- 7,11]。其中CXCL- 12是已知的唯一可直接调控HSC迁移的趋化因子，不仅调控HSC的归巢，而且能够使HSC龛中的HSC保持休眠状态，降低其对化疗的敏感性。虽然体外培养的MDS-MSCs中CXCL- 12的基因表达下降[22]，但是骨髓活检免疫组化结果显示MDS-MSCs中CXCL- 12的密度明显升高[23]，造成这种差异的原因可能是实验方法的不同，体外培养不能真实反映体内的病理生理情况[7]。此外，体外培养的MDS-MSCs中Jagged- 1的基因表达水平与MDS骨髓活检中免疫组化结果均表明MDS中Jagged- 1表达明显升高。MDS-MSCs中其他相关分子表达特点及其在MDS发病机制中的作用可参考其他文献[7,18]。

5 MDS来源的MSCs参与了MDS的疾病进展

尽管对MDS中造血细胞的遗传学和分子学进行大量的研究，尤其近10年来，随着第二代测序技术的广泛应用，发现超过40个基因突变不仅和患者的预后相关，而且其本身也是治疗的靶点。但是对MDS而言，这些突变的基因并不特异，不仅存在于AML患者，而且也存在正常人和意义未明的血细胞减少症患者，而后者中只有部分人群最终发生MDS，说明造血细胞本身的异常并不能完全阐明MDS的发生和发展[3]。

在小鼠骨髓MSCs中敲除加工miRNA的核酸内切酶基因Dicer1诱导造血细胞出现MDS样表现[8]，说明MSCs中的基因改变在MDS的形成过程中具有重要的作用。将NHD13融合基因转移到小鼠的造血细胞中形成MDS模型[2]，骨髓微环境中的MSCs及其分化的成骨细胞存在功能衰竭现象，将野生型造血细胞移植到MDS小鼠的骨髓后生成的髓系细胞比例明显增高，表明MDS来源的MSCs支持正常HSC的功能下降；将MDS小鼠的造血细胞移植到野生型小鼠中，MDS细胞向AML转化的速度和小鼠死亡率明显低于MDS的小鼠，说明MDS中MSCs功能异常参与了疾病的进展和转化。此外，MDS来源的MSCs与正常HSC的共培养体外实验表明：处于G0期的正常HSC的比例明显高于与正常MSCs共培养的结果(P<0.05)[11],说明MDS来源的MSCs抑制正常HSC的生长。

上述结果强烈表明MSCs的功能异常可能是MDS发生和发展的重要因素，但是由于动物和体外实验本身的局限性，直接将这些实验结果解释临床问题时需谨慎。随着实验技术的进步，目前原位异种移植试验能够较为真实的再现MDS患者临床特点[7,9]。直接在分泌人细胞因子NSGS小鼠骨髓中注射MDS造血细胞或与体外培养的MDS-MSCs共同注射，结果表明[9]：MDS-MSCs增强MDS患者的肿瘤细胞移植效率，70%的移植获得成功，而MDS造血细胞的单独移植7例实验中只有1例获得成功，二者之间存在显著的统计学差异(P<0.05)，说明MDS-MSCs促进MDS的HSC的增殖。临床检测也表明MDS-MSCs表现特点与患者的预后密切相关[19]：MSCs中存在异常染色体核型的MDS患者，其造血细胞易于合并复杂染色体核型，并且总生存期较正核型MSCs的患者短。骨髓活检免疫组化结果表明[23]：高危MDS患者的骨髓活检中MSCs的密度明显高于低危MDS和良性血细胞减少的患者，MDS-MSCs密度增高具有重要临床意义；在低危或中位MDS患者中MSCs密度增加的患者总生存期明显下降(57个月比18个月，P<0.05)，死亡的风险为为低/中等MSCs密度患者的3.4倍、进展为急性髓系白血病的风险是低/中等MSCs密度患者的2倍，说明MSCs的密度增加具有独立的预后意义。这可能是MDS-MSCs中CXCL- 12+密度明显高于良性病患者，MSCs可能通过与肿瘤细胞的直接作用降低肿瘤细胞对化疗的敏感性，为肿瘤细胞提供了保护性微环境[24]。

综上所述，动物实验、体外实验及MDS患者骨髓活检结果均说明MDS-MSCs存在的结构及功能异常在疾病进展过程中发挥了重要的作用，是MDS治疗的潜在靶点。目前既针对MDS中克隆性造血细胞又能对MDS-MSCs的异常功能产生影响的药物如去甲基化药物和来那度胺等已在部分MDS的治疗中取得显著治疗效果阶段[7]。此外，我们在试验中也发现小剂量的去甲基化药物地西他滨能够部分改善MDS-MSCs衰老相关基因的表达，并对MDS-MSCs的免疫调节功能产生了影响。

6 结论

目前越来越多的实验及临床结果表明MDS的肿瘤细胞和MSCs之间存在复杂的相互作用，通过这种作用MDS的肿瘤细胞重塑了MSCs的功能，使其有利于肿瘤细胞的增殖，降低肿瘤细胞对化疗的敏感性，同时不利于正常HSC的增殖，导致疾病进展。因此，了解MDS来源的MSCs及疾病进展中的作用,有助于加深对MDS发病机制复杂性的认识，针对MDS肿瘤细胞与MSCs之间的相互作用的靶向干预措施，有可能成为未来MDS的一种新的治疗方向。

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