ATM基因与胰腺导管腺癌发病及放疗增敏研究进展

刘显荣，卢先州

(南华大学附属南华医院肝胆外科，湖南 衡阳 421001)

胰腺导管腺癌(PDAC)是胰腺恶性肿瘤中最常见的病理类型，占胰腺癌病理分型的80%以上，是欧美国家死亡率排名第四的癌症，总体5年存活率在4%左右[1-2]。PDAC的发病机理极其复杂，涉及众多基因及蛋白的参与，深入探究影响其发病与进展的基因和信号通路，对PDAC的预防、早期诊断和治疗具有积极意义。共济失调毛细血管扩张症突变基因(ataxia-telangiectasia mutated gene， ATM)是重要的参与DNA损伤反应修复的基因，在维护正常DNA的完整性和稳定性方面起着重要作用，是重要的抑癌基因，其是否在PDAC的发病中同样起到重要作用，亦是众多学者关注的重点，他们试图找到有力的证据将ATM与PDAC联系起来。现围绕ATM基因与PDAC的发病及放疗增敏的研究进展作综述如下。

1 ATM基因概述

ATM基因是由Savitsky等[3]在1995年首次发现并命名的。它是机体重要的促修复基因，广泛存在于机体组织细胞中，正常健康个体以野生型为主，其编码产物ATM蛋白激酶分布于细胞核和细胞质中，以细胞核为主，通常情况下，ATM蛋白激酶以无活性的二聚体形式存在，解离后方具有生物学活性[4]。ATM蛋白激酶是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，最初观察到的功能是其在DNA损伤反应中的作用，当细胞DNA双链受辐射等损伤破坏后，可诱导丝氨酸1981位点 (ser-1981)的快速自动磷酸化，引起二聚体解离并引发细胞ATM激酶活性[5-6]。进一步的研究发现[7-8]，ATM蛋白激酶具有更广泛的整合和指导各种信号传导并维持细胞稳态的功能，这些功能包括调节染色质重构、氧化应激和多种组织中的细胞代谢。近年来越来越多的研究证明，ATM激酶是各种基因毒(genotoxins)如化疗药物及放射线所致DNA损伤生物学反应中同时起诸多信号转导通路的主导激酶(hieratical kinase)，这也是ATM倍受关注的最重要原因[9]。

细胞周期中发生DNA损伤后，ATM蛋白激酶通过磷酸化的方式而活化，并通过一系列蛋白底物如Chk2、p53、Nbs1和p38MAPK等而参与细胞周期的调控；在细胞周期的不同时期或不同应激条件下，ATM蛋白激酶作用于相应的效应底物而组成了不同的信号转导通路，主要包括p53通路 (Mdm2-P53、P21通路)、ATM-H2AX组蛋白信号通路、ATM-Chk2-Cdc25信号转导通路、ATM-Nbs1-Smc1/3信号通路、ATM-p38MAPK-MK信号通路等[10]。

2 ATM基因相关通路与胰腺肿瘤

ATM是DNA损伤反应的中枢调节剂，起着抗癌屏障的作用，当ATM基因缺失或沉默表达时，DNA损伤将得不到及时的修复，使受损的DNA双链通过复制而传递给子代，增加基因组不稳定性，并可促进腺泡至导管再编程(ADR)和肿瘤性病变形成，从而使恶性肿瘤的易感性大大提高[11]。既往的研究已经证实ATM基因的缺失或变异与乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤、口咽癌的发病相关[12]。国内外多项研究发现，ATM基因在胰腺癌的发病中同样扮演着重要的角色。

Roberts等[13]新一代全基因测序研究发现，遗传性的ATM突变在家族性胰腺癌易感性中发挥重要作用，并首次将ATM基因添加到了PDAC易感基因列表当中。Drosos等[14]研究者对Kras G12D诱导的小鼠胰腺导管内瘤样变(PanIN)形成的初步分析揭示，与无ATM基因缺失的小鼠相比，在携带一个功能性ATM等位基因或缺乏ATM的胰腺组织中，胰腺癌癌前病变PanIN过程显著提前，推断ATM基因活动对胰腺中的致癌转化构成内在屏障作用，ATM缺失可能和KrasG12D合作促进了小鼠的广泛转移性胰腺导管腺癌。ATM基因不仅与胰腺癌的发病相关，其表达程度与肿瘤的分化、转移、预后等亦有重要相关性。在胰腺癌标本中，ATM及其下游基因p53表达的阳性染色率显著低于同年龄段的对照组标本，肿瘤的分化、淋巴结转移和神经浸润程度与ATM和p53的表达呈负相关，说明ATM除了具有与p53合作修复细胞损伤的作用外，ATM缺陷的表达还可能增加正常胰腺细胞向肿瘤细胞转化的能力[15]。Kamphues等[16]依据ATM表达程度对PDAC的预后进行分层，发现Ser1981-ATM完全丧失的患者预后最差，完全丧失、低表达及高表达患者的中值存活时间分别为10.8个月、14.3个月、31.1个月，差异具有统计学意义(P<0.01)，表明ATM表达和激活是PDAC中的标准临床病理参数的预后标识物。而ATM不同的基因型对胰腺癌的预后亦存在差异，其中T77C基因型对胰腺癌患者整体生存率的影响最显著[17]。ATM基因所参与的信号传导通路错综复杂，上述研究仅说明ATM基因缺失与PDAC的发病及较差的预后相关这一事实，明确相关通路在当中所发挥的作用才是其关键点。随着对ATM基因研究的深入，大家把关注焦点聚集在ATM基因对肿瘤发生的抑制机制上，探究ATM基因缺失作为胰腺癌易感因素的分子生物学机制。

2.1 SOX9-EMT路径 Russell等[18]研究发现，在ATM基因缺失的小鼠中，腺泡-导管化生/腺泡-导管重编程(ADM/ADR)过程明显增强，其机理是通过改变TGFb超家族信号传导实现的，在形态完整的腺泡组织及ADM/ADR中，导管转录因子SOX9基因表达显著上调，SOX9是ADM和ADR的驱动力，并与腺泡结构中的导管编程的癌症经历上皮-间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)高度相关，EMT是胚胎发育过程中高度丰富的过程，并对肿瘤的微环境存在着深刻影响，与支持肿瘤生长的生长因子的分泌和积累相关；在ATM耗尽的胰腺癌前期病变中，存在着高水平表达的锌指蛋白类转录因子(ZEB1)和其他的EMT标识物，表明管道编程与正在进行的EMT存在显著相关性。而ZEB1是EMT的始动因子，是恶性肿瘤转移和多能干性的标识物，被认为是PDAC中死亡率的独立预测因子[19]。在SOX9-EMT路径中，SOX9基因表达上调是关键一环，而SOX9基因在多种癌症类型和正常上皮细胞中是通过独立于p53、ATM、ATR和DNA-PK的途径主动降解的[20]，在ATM基因缺失的胰腺癌组织中观察到的SOX9基因上调可能存在另外的途径。

2.2 ATM-P53-Mdm2-P21WAF/CIPI通路 于观贞等[15]应用组织芯片和免疫组化法研究ATM及相关通路基因P53、Mdm2和 P21WAF/CIPI等在167例胰腺外分泌性恶性肿瘤和101份癌旁组织以及11例胰腺良性病变中的表达情况，发现与非癌组织相比，癌组织中P53和Mdm2表达明显升高，而ATM和P21WAF/CIPI的表达明显降低，认为P53和Mdm2的过表达以及ATM和P21的沉默表达可能会导致胰腺癌的形成和进展；4种蛋白可能以ATM-P53-Mdm2-P21WAF/CIPI通路的方式促进细胞的转化和肿瘤的形成；联合检测ATM下游基因如P53和Mdm2的表达或可用于评定胰腺癌的恶性程度。同时在Kim等[21]的研究中亦检测到胰腺导管腺癌中ATM和P53的表达异常，与无胰腺癌家族史患者相比，有胰腺癌家族史的患者ATM缺失率明显升高；胰腺癌患者ATM蛋白表达缺失，但P53仍正常表达者，在胰腺切除术后总生存期较差，是降低总生存的独立预测因素。众所周知，ATM-P53通路是重要的促DNA损伤修复路径，能促进细胞的修复及诱导凋亡，与上述结论相矛盾。ATM-P53-Mdm2-P21WAF/CIPI通路在PDAC组织中存在表达异常，并与较差的预后相关，是否因ATM基因缺失导致，以及在正常胰腺细胞向肿瘤细胞转化过程中，该通路作为始动因素的证据并不充分。

3 ATM与胰腺癌放射抗性

放射治疗是目前对中晚期胰腺癌的主要治疗方法之一，辐射抗性是影响放疗效果的重要因素。在电离辐射造成组织细胞DNA损伤时，ATM激酶依赖性G2/M检测站被激活，从而介导辐射抗性，通过抑制DNA修复途径可使癌细胞对辐射的影响更加敏感，而ATM/Chk2和ATR/Chk1途径是细胞周期阻滞的主要调节剂，通过选择性抑制ATM基因可使DNA双链断裂修复过程发生障碍，从而表现出对辐射的高度敏感[22-23]。但ATM介导的辐射抗性分子机制尚缺乏统一机制，而在胰腺癌的放疗抗性机制与其他的恶性肿瘤是否一致亦无明确答案。有研究者已经证实ATM/Chk1基因在姜黄素介导的胰腺癌细胞G2/M周期停滞和凋亡中起到关键作用，以siRNA转染方式沉默ATM基因表达后，胰腺癌细胞G2/M周期阻滞率显著下降[24]。Wang等[25]研究发现，ATM信号传导通路中的下游信号分子共济失调毛细血管扩张症组相关基因(ataxia telangiectasia group D complementing gene，ATDC)为电离辐射耐受性的决定性因素，其活化需要MK2激酶催化Ser-550位点的磷酸化，从而导致ATDC与Dvl2的解离[24]。ATDC执行两个重要但独立的功能，它通过β-连环蛋白(β-catenin)信号促进增殖并通过ATM/MK2信号通路促进放射抵抗性。那么在沉默ATM基因后，ATM/MK2信号通路受阻，ATDC基因无法解离，胰腺癌细胞的放射敏感性必将增加。Hennig等[26]在研究APPL蛋白介导的放射抗性的作用机理时发现，APPL蛋白和ATM激酶在胰腺癌细胞受辐射后，将第一时间被激活，成为DNA修复重要调节剂；辐射后被激活的APPL1和ATM之间存在交互作用，APPL蛋白可通过调节ATM表达从而调节胰腺癌细胞的DNA修复和放射生存，在APPL敲除介导的放射增敏试验中，观察到在辐射后ATM磷酸化显著减少，提示ATM是APPL介导的对放射敏感性和DNA修复影响的中心调节剂，ATM是APPL介导的放射抗性必不可少的环节，APPL蛋白的额外耗尽与单独ATM敲除具有同样的放疗增敏效果，表明ATM和APPL蛋白可能是相同信号传导轴的一部分。另有研究者发现Pim-3家族在胰腺癌细胞的放射抗性中起着重要作用，辐射诱导可诱导Pim-3过表达，进而增强PDAC放射抗性；其机理是阻止γ-H2AX焦点的形成，并增加ATM基因磷酸化表达，进而激活Chk1和p53；Pim-3与ATM之间存在相互作用并增加ATM的磷酸化，敲除胰腺癌细胞中ATM可逆转Pim-3对辐射的保护作用[27]。赵晶等[28]研究吉西他滨用于体外对胰腺癌细胞的放疗增敏作用时亦发现，与空白对照组、单纯照射组、吉西他滨组比较，联合吉西他滨及放疗组ATM蛋白的表达明显降低(21.8%)，而胰腺癌细胞的克隆形成能力，即增殖能力显著降低，表明ATM基因是放疗增敏的潜在靶点，但并未从分子生物学层面来阐明其作用机理。

特异性抑制肿瘤细胞ATM基因表达是胰腺癌放疗增敏的先决条件。目前ATM的抑制剂正在积极开发用于治疗各种癌症，如咖啡因、甲基黄嘌呤生物碱、KU-55933及其类似物、AZD0156等[29，23]，这些药物在体外或动物试验中确能起到较好的抑制ATM基因作用，但均存在一些问题亟待解决，临床应用受到一定限制。

4 结语及展望

综上所述，ATM基因的沉默是PDAC发病的高危因素，并与较差的肿瘤分化程度、浸润、生存期相关，其主要机理是围绕DNA损伤反应发生的，涉及多条信号转导通路。在胰腺癌的治疗中，ATM基因有望成为胰腺癌治疗的靶基因，通过抑制ATM基因能增加肿瘤细胞对放疗的敏感性，从而提高中晚期胰腺癌的治疗效果，改善患者预后，其机理亦与ATM基因介导的DDR的修复相关。然而恶性肿瘤的发生、发展是一个多基因、多通路的过程，进一步研究胰腺癌中ATM通路中上下游基因的变化与功能，以及其他通路的变化情况，尤其是作为始动因素方面的研究，可能会更好地阐明PDAC的发病机理和解释其恶性行为。虽然多项研究均表明ATM基因与胰腺导管腺癌的密切关系，但其分子生物学层面的机理并不明确，现在研究多局限于动物实验。而通过抑制ATM基因来提高胰腺癌放疗的疗效亦局限于动物实验及体外实验，尚无理想的ATM抑制剂进入临床试验。另一方面，在放疗增敏时，胰腺癌组织ATM基因抑制后，势必影响正常胰腺组织的ATM基因表达而对放射线的敏感性增加，如何在对肿瘤组织增敏的同时保护正常组织亦是需要研究的课题。

[1]FRAKES J M， STROM T， SPRINGETT G M， et al. Resected pancreatic cancer outcomes in the elderly[J]. J Geriatr Oncol， 2015， 6(2)： 127-132.

[2]POURHOSEINGHOLI M A， VAHEDI M， BAGHESTANI A R. Burden of gastrointestinal cancer in Asia； an overview[J]. Gastroenterology and Hepatology from Bed to Bench， 2015， 8(1)： 19-27.

[3]SAVITSKY K， BAR-SHIRA A， GILAD S， et al. A single ataxia telangiectasia gene with a product similar to PI-3 kinase[J]. Science， 1995， 268(5218)： 1749-1753.

[4]卫佳，吴楠，孙海明，等.ATM信号通路与肿瘤的发展及治疗[J].国际遗传学杂志，2016，39(2)：90-95.

[5]BAKKENIST C J， KASTAN M B. DNA damage activates ATM through intermolecular autophosphorylation and dimer dissociation[J]. Nature， 2003， 421(6922)： 499-506.

[6]MATSUOKA S， BALLIF B A， SMOGORZEWSKA A， et al. ATM and ATR substrate analysis reveals extensive protein networks responsive to DNA damage[J]. Science， 2007， 316(5828)： 1160-1166.

[7]MU J J， WANG Y， LUO H， et al. A proteomic analysis of ataxia telangiectasia-mutated (ATM)/ATM-Rad3-related (ATR) substrates identifies the ubiquitin-proteasome system as a regulator for DNA damage checkpoints[J]. J Biol Chem， 2007， 282(24)： 17330-17334.

[8]MORRISON C， SONODA E， TAKAO N， et al. The controlling role of ATM in homologous recombinational repair of DNA damage[J]. EMBO J， 2000， 19(3)： 463-471.

[9]宋宜，孟祥兵，梅柱中，等.DNA损伤生物学反应中ATM对p21WAF1/CIP1蛋白的直接磷酸化[J].中国生物化学与分子生物学报，2002，18(3)：277-281.

[10]刘小群.ATM与肿瘤的关系研究进展[J].中国癌症杂志，2011，12(12)：973-977.

[11]BARTKOVA J， HOREJSZ， KOED K， et al. DNA damage response as a candidate anti-cancer barrier in early human tumorigenesis[J]. Nature， 2005， 434(735)： 864-870.

[12]CHOI M， KIPPS T， KURZROCK R. ATM mutations in cancer： therapeutic implications[J]. Mol CancerTher， 2016， 15(8)： 1781-1791.

[13]ROBERTS N J， JIAO Y， YU J， et al. ATM mutations in patients with hereditary pancreatic cancer[J]. Cancer Discov， 2012， 2(1)： 41-46.

[14]DROSOS Y， ROYS K， KULIYEV E， et al. Abstract a06： ATM loss and KrasG12D cooperate to promote widely metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma in mice[J]. Cancer Res， 2015， 75(13 Supplement)： A06-A06.

[15]YU G Z， ZHU M H， CHEN Y， et al. Expression and clinical significance of P53 pathway-associated proteins in pancreatic carcinoma[J]. Ai Zheng， 2005， 24(11)： 1398-1403.

[16]KAMPHUES C， BOVA R， BAHRA M， et al. Ataxia-telangiectasia-mutated protein kinase levels stratify patients with pancreatic adenocarcinoma into prognostic subgroups with loss being a strong indicator of poor survival[J]. Pancreas， 2015， 44(2)： 296-301.

[17]LI D， FRAZIER M， EVANS D B， et al. Single nucleotide polymorphisms of RecQ1， RAD54L， and ATM genes are associated with reduced survival of pancreatic cancer[J]. J Clin Oncol， 2006， 24(11)： 1720-1728.

[18]RUSSELL R， PERKHOFER L， LIEBAU S， et al. Loss of ATM accelerates pancreatic cancer formation and epithelial-mesenchymal transition[J]. Nat Commun， 2015， 6(6)： 7677.

[19]WELLNER U， SCHUBERT J， BURK U C， et al. The EMT-activator ZEB1 promotes tumorigenicity by repressing stemness-inhibiting microRNAs[J]. Nat Cell Biol， 2009， 11(12)： 1487-1495.

[20]HONG X， LIU W， SONG R， et al. SOX9 is targeted for proteasomal degradation by the E3 ligase FBW7 in response to DNA damage[J]. Nucleic Acids Res， 2016， 44(18)： 8855-8869.

[21]KIM H， SAKA B， KNIGHT S， et al. Having pancreatic cancer with tumoral loss of ATM and normal TP53 protein expression is associated with a poorer prognosis[J]. Clin Cancer Res， 2014， 20(7)： 1865-1872.

[22]李革.ATM基因与大肠癌放射敏感性关系的研究进展[J].世界华人消化杂志，2012，20(25)：2337-2340.

[23]YANG S H， KUO T C， WU H， et al. Perspectives on the combination of radiotherapy and targeted therapy with DNA repair inhibitors in the treatment of pancreatic cancer[J]. World Journal of Gastroenterology， 2016， 22(32)： 7275-7288.

[24]SAHU R P， BATRA S， SRIVASTAVA S K. Activation of ATM/Chk1 by curcumin causes cell cycle arrest and apoptosis in human pancreatic cancer cells[J]. Br J Cancer， 2009， 100(9)： 1425-1433.

[25]WANG L， YANG H， PALMBOS P L， et al. ATDC/TRIM29 phosphorylation by ATM/MAPKAP kinase 2 mediates radioresistance in pancreatic cancer cells[J]. Cancer Res， 2014， 74(6)： 1778-1788.

[26]HENNIG J， MCSHANE M P， CORDES N， et al. APPL proteins modulate DNA repair and radiation survival of pancreatic carcinoma cells by regulating ATM[J]. Cell Death Dis， 2014， 5(4)： e1199.

[27]CHEN X Y， WANG Z， LI B， et al. Pim-3 contributes to radioresistance through regulation of the cell cycle and DNA damage repair in pancreatic cancer cells[J]. Biochem Biophys Res Commun， 2016， 473(1)： 296-302.

[28]赵晶，韩苏夏.吉西他滨对放射相关DNA损伤修复的影响[J].西部医学，2014，26(9)：1109-1112.

[29]HICKSON I， ZHAO Y， RICHARDSON C J， et al. Identification and characterization of a novel and specific inhibitor of the ataxia-telangiectasia mutated kinase ATM[J]. Cancer Res， 2004， 64(24)： 9152-9159.