荧光原位杂交技术及其应用

钱文丹 陈波利

（贵州大学，贵州 贵阳 55000）

1 荧光原位杂交技术原理

荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization，FISH）是一种重要的非放射性原位杂交技术。其基本原理是如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性—退火—复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析［1］。与其他杂交技术进行综合比较发现，荧光原位杂交技术（FISH）具有一些优势：循环周期短，稳定性高，非常安全；分辨率高，为3～20 Mb；探针能较长时间保存；多色标记，简单直观；在荧光显微镜下在同一切片上同时观察几种DNA探针的定位，直接得到其相对序列和位置，从而大大加速生物基因组和功能基因组定位的研究。

2 荧光原位杂交技术要点

FISH选用的标本可以是分裂期细胞染色体，也可以是间期细胞。生物素、地高辛、Dinitrophenyl（DNP）、Aminoacetyl Fluorine（AAF）等均可用于探针标记。近年来，大片段的DNA探针（100～400 kb）已被研制出来，由于控针较长，故可将荧光物质直接标记在核苷酸上，使杂交过程进一步简化，而且杂交信号更强。

荧光原位杂交可以通过CCD（电荷耦合器件）相机系统或激光共聚焦扫描成像系统将摄取的信号存储在计算机中，经过软件特殊处理后显示在屏幕上。使用数码成像相机系统或CCD相机系统，灰度图像被拍摄几次并存储在计算机中，接下来通过一些人造色，软件系统接收获得的示例图像，经过软件的综合处理，最后以多色图像显示出来。此外，在G-带状染色体被75酒精或甲醇褪色后，FISH可以更清楚地识别易位。

FISH技术和RFLP（Restrict Fragment Lenth Polymorphysim）结合，可以更准确地描述染色体长短臂的结构变化以及染色体梳子或复制品的性质。FISH和细胞免疫技术结合，可以同时用多种颜色反应检测不同的核苷酸链和蛋白质［2］。在基因图谱绘制中，FISH和连锁图谱结合起来，可以准确确定具有高多态性的基因位点。

3 荧光原位杂交技术的发展

荧光原位杂交技术起源于1969年，自1990年以来，FISH在方法上形成了从一种颜色到多种颜色、从中期染色体FISH到粗线染色体FISH再到纤维-FISH的发展趋势，灵敏度及分辨率有了大幅度提高。

3.1 多色荧光原位杂交

多色荧光原位杂交（M-FISH），“M”分别代表“Multicolor”“Multiplex”和“Multitar get”3 种类型。M-FISH 的最大特点是可以在单个FISH实验中进行多个繁琐的FISH实验和多个不同基因的定位。以下5种方法是基于多色彩FISH基础上开发的新技术：染色体描绘、比较基因组杂交、光谱染色体自动核型分析、交叉核素色带分析及多彩色原位启动标记［3］。

3.2 DNA纤维荧光原位杂交技术（DNA fiber-FISH）

Wiegant等首先利用化学方法染色体进行线性化，再以此线性化的染色体DNA作为载体进行FISH，使FISH的分辨率显著提高，就是最初的纤维-FISH。据一些文献记载，逐渐改进了DNA纤维舒展延伸的方法，使DNA纤维的伸展程度有了很大的变化。DNA纤维荧光原位杂交的关键在于如何制备具有高分辨率且高质量的线性DNA纤维，能进行定量分析。

3.3 组织微阵排列技术

微阵列可以在一个实验中检测一个细胞中数百个基因的表达（减少和增加）。组织微阵列由组织微阵列区域中的500～1 000个单个肿瘤组织与管状活组织检查组成。细胞的组织和cDNA微阵列技术的组合可以提供一种有力的体内鉴定基因的方法，可以对一些疾病及瘤的分子变化进行重要评估。

3.4 荧光免疫核型分析和间期细胞遗传学（FICTION）

FICTION是一种将荧光免疫核型分析和原位杂交相结合的方法，可以同时显示异种细胞群中单个肿瘤细胞的免疫表型和一定的基因变化。FICTION具有诊断快速且可以再现的优点，适用于FISH分析前或后没有所需以前细胞样品的细胞学样本。FICTION可用于分析血液肿瘤的系谱，更好地了解肿瘤病理组织。

4 荧光原位杂交技术的应用

据文献报道，荧光原位杂交技术已经被应用于多个领域。例如，染色体结构变异的检测，可以较容易地检测出缺失、附加或替换的染色体；可用于产前诊断，近年来此项技术已用于诊断唐氏综合征、膀胱癌等［4-5］；可用于基因定位，即利用激光共聚焦和其他荧光透视法观察基因的位置；还可以用于血液肿瘤检测。也有很多文献报道了荧光原位杂交与其他技术的联用，如与免疫、量子点、微流控芯等技术联用，提高了效率，缩短了周期。