外泌体在疾病实验诊断和临床治疗中的研究进展*

蒲双双，李金星 (山东中医药大学附属医院检验科，济南250011)

外泌体是直径介于40～100 nm之间的囊泡样结构，外层由双层磷脂膜包裹，内含有丰富的micro RNA及蛋白质等成分。外泌体分布广泛，存在于血液、尿液、唾液、脑脊液，以及胸腹腔积液等几乎所有体液中，无创易获取。

外泌体的形成不同于普通微泡的出芽脱落，而是选择性地富集其来源细胞中的一些分子形成多胞体，然后在RAB酶等的作用下与细胞膜融合释放。被选择的分子可以显示外泌体来源，也可以反映来源细胞的生理病理状态，提示外泌体有应用于疾病诊断的潜质。更重要的是，外泌体中miRNA和蛋白质丰度远高于血清，提示外泌体组分作为诊断标志物将更为敏感。基因检测技术和蛋白质组学的发展，也使检测外泌体组分用于疾病诊断成为可能。

外泌体参与物质运输，通过各种机制在生物信息传递中发挥重要作用。外泌体作为天然的细胞生物信息传递工具，因其低免疫原性、能越过生物屏障、能归巢靶组织、能有效入侵受体细胞等特性，被认为是基因和药物靶向治疗的最佳运输载体。另外，基于外泌体在疾病发生发展中起重要作用，抑制外泌体的分泌以及干扰其特定分子的表达以增强机体免疫力也是疾病治疗的新方法。外泌体还有被开发成肿瘤疫苗的潜质。

本文就近五年来血液和尿液来源的外泌体中miRNA和蛋白质组分在人体各个系统疾病实验诊断方面的相关研究以及外泌体在疾病临床治疗尤其是肿瘤治疗中的研究进展作如下综述。

1 外泌体用于各系统疾病实验诊断的相关研究进展

1.1 消化系统

1.1.1 胰腺癌:Melo等［1］认为磷脂酰肌醇聚糖1(glypican-1，GPC1)可以作为胰腺癌的早期诊断指标，因为从早期胰腺癌患者血清中可以检测到GPC1+循环外泌体，而在健康对照组及胰腺良性病变患者的血清中未检测到GPC1+循环外泌体。另外，对GPC1+外泌体进行定量，可间接反映胰腺癌瘤体的大小，且可早于核磁共振发现胰腺上皮细胞的病变。Madhavan等［2］发现胰腺癌患者外泌体中4种蛋白(CD44v6，Tspan8，Ep CAM 和 CD104)及 4种 miRNA(miR-1246，miR-4644，miR-3976 和 miR-4306)高表达，可达到区分胰腺癌与健康人及良性胰腺疾病的目的。Que等［3］发现胰腺癌患者miR-17-5p和miR-21的含量显著升高，尤其是高水平的miR-17-5p可能与胰腺癌的转移有显著关系。Costa-Silva等［4］认为，巨噬细胞迁移抑制因子(macrophage migration inhibi-tory factor，MIF)可能是胰腺导管癌发生肝转移的预后指标。

1.1.2 肝癌:Sohn等［5］对肝癌和乙肝患者血清来源外泌体的miRNA进行了对比，发现肝癌患者血清外泌体中miR-18a，miR-221，miR-222和miR-224的含量明显高于乙肝组，而 miR-101，miR-106b，miR-122和miR-195含量则明显降低。Sugimachi等［6］则发现肝癌患者血清外泌体中miR-718与正常人相比显著下降。以上都提示这些miRNA可能作为肝癌诊断和判断预后的标志物。

He等［7］在肝癌细胞侵袭性的研究中发现，MET蛋白可能在肝癌侵袭中发挥重要作用，摄取其外泌体后的非侵袭细胞侵袭力增强。这提示MET可能成为预测肝癌转移的标志物。

1.1.3 胃癌:Li等［8］在关于胃癌的研究中发现，LINC00152在胃癌患者血清来源外泌体中高表达，显著高于胃上皮异型增生组与健康人，且手术后有明显降低。LINC00152具有胃癌诊断的潜能。

1.1.4 肠癌:Ogata-Kawata等［9］的研究结果显示7种 miRNA(let-7a，miR-1229，miR-1246，miR-150，miR-21，miR-223和miR-23a)在大肠癌患者血清外泌体中高表达并显著高于健康对照组，且在手术前后含量水平有明显改变。其中的miR-23a和miR-1246灵敏度很高，高于现用肿瘤标志物CA-199和CEA，可作为大肠癌的诊断标志物。Matsumura等［10］指出miR-19a在原发性肠癌的早期就开始高表达，并且miR-19a高表达患者的预后更差。

据Tauro研究［11］，在突变型结肠癌细胞分泌的外泌体中EpCAM，CLDN7和CD44等蛋白高表达，这些蛋白能促进结肠癌细胞的生长和扩散。Yoshioka等［12］认为外泌体 CD147可替代 CA-199和CEA成为新的结直肠癌肿瘤标志物。

1.2 呼吸系统 肺癌:Cazzoli等［13］对血液外泌体中的miRNA进行了大量比对分析，结果显示有4种 miRNA(miR-378a，miR-379，miR-139-5p 和 miR-200b-5p)可将肺癌和肺肉芽肿患者与健康人群区分开，可作为肺癌的筛查标志物;而有6种miRNA(miR-151a-5p，miR-30a-3p，miR-200b-5p，miR-629，miR-100和miR-154-3p)可有效区分肺癌和肺肉芽肿患者，可作为肺癌的诊断标志物。Munagala等［14］作了外泌体miRNA用于肺癌复发诊断的研究，他们发现miR-21和miR-155在原发性肺癌和复发性肺癌患者中水平有显著差异，是肺癌复发诊断的潜在生物学标志物。

除了miRNA，蛋白质也在肺癌诊断中起重要作用。据研究，血液来源外泌体高表达CD317、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)等，可用于诊断非小细胞肺癌［15］。

1.3 神经系统

1.3.1 胶质细胞瘤:Manterola等［16］研究发现多形性恶性胶质瘤的患者血清外泌体中有7种miRNA(miR483-5p，miR-574-3p，miR-320，miR-197，miR-484，miR-146a和miR-223)和1种snctRNA(RNU6-1)的表达水平与正常人相比有显著差异，并且RNU6-1与miR-574-3p，miR-320联合应用，可作为多形性恶性胶质瘤早期诊断的生物标志物，具有较高灵敏度和特异度。

1.3.2 阿尔茨海默病:Lugli等［17］通过分析阿尔茨海默病患者血清来源外泌体miRNA，发现miR-342-3p的下调可作为诊断老年痴呆的独立生物学标志物。

1.3.3 帕金森病(PD):Dong等［18］将实验者按年龄、疾病分期、左旋多巴剂量、性别等配对分析后发现，DJ-1在PD患者尿外泌体中水平与非PD患者有明显差异，说明尿外泌体DJ-1蛋白质可作为PD诊断的潜在标志物。

1.3.4 多发性骨髓瘤:Roccaro等［19］运用 micro RNA芯片和蛋白质组学对多发性骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞来源外泌体组成进行分析，发现miR-15a比健康人明显下调，而 IL-6，CCL2和 fibronectin明显上调，它们可以作为多发性骨髓瘤的诊断标志。

1.4 心血管系统 心肌梗死:Matsumoto等［20］采集了有急性心肌梗死病史的患者血清，检测发现miR-192的水平明显上升，并且与心肌梗死后心力衰竭状态有相关性。

1.5 泌尿系统

1.5.1 急性肾损伤:Chen等［21］发现，急性肾损伤患者尿液外泌体中激活转录因子3(activating transcription factor 3)的水平是正常对照组的约60倍，提示其具有特异性诊断标志物的潜力。

1.5.2 慢性肾病:Lu等［22］运用RT-PCR检测慢性肾病患者尿液外泌体中的miRNA，结果显示miR-29，miR-200相比于健康人有明显下降。并且miR-29a和miR-29c与慢性肾脏病患者肾小管间质纤维化密切相关，可以区分中度和重度肾纤维化。Lu等［23］的研究还发现，肾病患者尿外泌体中CD2相关蛋白mRNA(CD2AP mRNA)水平随着尿蛋白增加而下降，与肾纤维化程度呈负相关。

1.5.3 糖尿病肾病:Barutta等［24］对1型糖尿病早期肾损伤患者尿外泌体的miRNA进行基因芯片分析，发现miR-145较无肾损伤组表达升高。他们还在动物试验中发现高糖刺激肾小球系膜细胞后，尿外泌体中的miR-145含量升高，验证了miR-145有可能取代尿微量蛋白成为糖尿病肾病早期诊断的新标志物。

Kalani等［25］的研究发现尿外泌体蛋白WT1在糖尿病患者中蛋白尿组和非蛋白尿组的水平有明显差异，可作为诊断早期糖尿病肾病的生物标志物。

1.5.4 狼疮性肾炎:Sole等［26］发现尿外泌体中的miR-29c能很好地预测狼疮性肾炎肾纤维化的程度。

1.5.5 多囊肾:Hogan等［27］对多囊肾患者尿外泌体蛋白质谱的研究发现，与多囊肾病理过程相关的多囊蛋白质1(PC1)和多囊蛋白质2(PC2)减少约一半，而跨膜蛋白质2(TMEM2)升高了约两倍，所以推测尿外泌体PC1/TMEM2及PC2/TMEM2的比值可用于诊断多囊肾。

1.6 男性生殖系统 前列腺癌:Huang等［28］对前列腺癌患者血清外泌体中miRNA进行了分析，发现miR-1290和miR-375呈高表达，与患者生存期密切相关，且可作为难治性前列腺癌的诊断标记物。Li等［29］的研究发现，前列腺癌患者外泌体miR-141水平显著高于良性前列腺疾病患者，而且转移性前列腺癌中miR-141水平明显高于非转移性前列腺癌。另外，Isin等［30］对前列腺癌患者尿外泌体的组分进行研究，发现miR-107和miR-574-3p比正常组上升，linc RNA-p21水平在两组间有显著差异，这些RNA对于前列腺癌的诊断和预测都有帮助。

Bijnsdorp等［31］发现，相比良性前列腺增生及前列腺癌，转移性前列腺癌患者尿外泌体中含有更高浓度的迁移侵袭相关的蛋白质，如整合素α-3(ITGA3)及整合素 β-1(ITGB1)，ITGA3及 ITGB1可作为转移性前列腺癌的蛋白标志物。

1.7 女性生殖系统 卵巢癌:Meng等［32］对卵巢癌患者血清外泌体中miRNA进行检测，发现肿瘤组 miR-373，miR-200a，miR-200b 和 miR-200c水平比良性疾病和健康组显著升高，并且 miR-200a，miR-200b和miR-200c可能与患者生存率相关。

2 外泌体用于疾病临床治疗的相关研究进展

2.1 作为基因和药物运送载体 外泌体可以携带许多重要分子，如:脂质、蛋白质、基因等进入受体细胞，从而影响受体细胞的生理病理过程。基于以下优势，外泌体成为众多学者心中理想的基因和药物运送载体。①天然无毒:相对于其他运载体，外泌体具有较低免疫原性，载体不会造成治疗性物质在肝脏的累积，无毒，不会出现严重不良反应。另外，外泌体表面表达有CD55及CD59，能避免调理素、补体或凝血因子等的激活，具有较低免疫原性。②稳定:外泌体外有双层脂质膜保护，其内容物不易被各种酶降解，能高效稳定的将装载物运送到目标组织。③纳米级:外泌体直径在40～100 nm之间，可以避免巨噬细胞(可吞噬超过100 nm的颗粒)的吞噬，而且能自由穿透血管进入细胞外基质发挥作用。④具有穿透生物屏障的能力:外泌体有能力穿过具有多层结构的血脑屏障，其机制可能与其在细胞之间通过多囊泡体进行传递有关［33］。⑤有归巢靶组织的能力:外泌体具有的靶向性与其来源细胞有关，因为外泌体可以选择性地富集来源细胞上构象相同的跨膜蛋白，这些跨膜蛋白可以结合归巢肽，使其具有定向归巢能力［34］。另外，还能人为对外泌体进行膜修饰从而增强其细胞特异性靶向作用。⑥有类似病毒侵入受体细胞的高效机制。⑦有多种方法装载基因和药物:常用装载方法有:1)对外泌体来源细胞进行化学转染或将装载物与来源细胞共孵育，使来源细胞分泌出有装载物的外泌体。2)利用电穿孔、化学转染、共孵育或反复冻融等方法直接把基因或药物转入外泌体。

近年来已有许多用外泌体实现靶向运送的报道:2013年，Aucher等［35］利用外泌体将人巨噬细胞来源的miR-142和miR-223转移给肝癌细胞，成功抑制了肿瘤细胞的增殖和生长，为肝癌的治疗提供了新方法。2014年，Tian等［36］在外泌体表面展示了一个能靶向肿瘤血管的小肽，并装载了化疗药物阿霉素。修饰后外泌体成功将阿霉素运送到乳腺癌组织中，抑制了小鼠肿瘤的生长。2015年，Yang等［37］借助脑内皮细胞外泌体携带抗肿瘤药物，实现了药物顺利通过血脑屏障发挥抑制脑肿瘤的作用。

2.2 抑制外泌体数量和作用 外泌体在介导肿瘤的发生与发展中起重要作用，因此抑制外泌体的分泌或摄取，成为一种新的抗癌策略。Marleau等［38］就提出体外过滤外周血中的外泌体可作为肺癌治疗的新疗法。Fabbri等［39］也发现使用中性鞘磷脂酶抑制剂GW4869能抑制小鼠体内外泌体的产生，并减少肺癌的转移。

2.3 人为干预外泌体以增强机体抗肿瘤免疫 上调外泌体特定内容物的表达可以增强机体的抗肿瘤免疫。李秋文等［40，41］的研究发现，组蛋白去乙酰化酶抑制剂MS-275和抗癌药物可促进Hep G2或Hep3B细胞分泌携带有HSP70，HLA-Ⅰ和CD80等蛋白的外泌体，它能诱导免疫细胞活性，增强机体的抗肿瘤免疫。

2.4 有望开发成肿瘤疫苗 Gorete等［42］发现树突状细胞等抗原递呈细胞被肺癌细胞相关抗原刺激后能产生携带有特异癌抗原的外泌体，这些外泌体迁移到区域淋巴结，可激活CD4+和CD8+T淋巴细胞产生强大的抗肿瘤免疫反应，起到类似疫苗的作用。因此，开发以外泌体为基础的肿瘤疫苗是癌症治疗的新思路。