HBV感染并发血小板减少患者外周血中CD4+CD25+调节性T细胞的表达研究*

刘雯洁，莫秋玉，林文远，林 玮，卓梅芳，刘 源，蒋端凤，董 敏

(1.桂林医学院，广西桂林 541004;2.桂林医学院附属医院血液科，广西桂林 541001)

人体外周血中CD4+CD25+调节性T细胞是一群具有免疫抑制功能的调节性T细胞［1］。多项研究显示，长期的乙型肝炎病毒(HBV)感染与外周血中血小板减少存在相关性［2～4］。乙肝病毒感染并发血小板减少是指伴HBV感染的免疫性血小板减少症(ITP)［5］，除外 ITP本身疾病因素，乙肝病毒感染可能是本病血小板减少的原因之一［6］。本研究通过检测12例HBV感染并发血小板减少患者与10例健康体检者外周血中CD4+CD25+调节性T细胞的表达情况，探讨HBV感染并发血小板减少可能的发病机制。

1 材料与方法

1.1 研究对象 实验组为12例2017年3～11月在桂林医学院附属医院住院及门诊患者，均符合ITP诊断标准［7］，并且乙肝系列检测HBsAg定量增高，符合HBV感染［8］，其中男性患者7例，女性患者5例，年龄35～85岁。对照组10例为同期体检的健康个体，男性3例，女性7例，年龄21～75岁。

1.2 试剂和仪器 FITC标记的鼠抗人CD25单抗、PE-Cy5标记的鼠抗人CD4单抗及BD FACSTMLysing Solution(10x)均为 BD Biosciences公司产品;淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物公司;FACS Calibur流式细胞仪为Becton Dickinson公司。

1.3 方法

1.3.1 分离单个核细胞:所有研究对象用EDTA抗凝管抽取静脉血2.0 ml，加入PBS液2.0 ml稀释后，用淋巴分离液常规分离获得单个核细胞，加入FACSTMLysing Solution(10x)悬浮细胞，使细胞浓度调整为1.0×107/ml。

1.3.2 细胞免疫荧光染色:取上述悬浮细胞100 μl，分别加入 CD25-FITC，CD4-PE-Cy5 各 20 μl，混匀后室温避光孵育15 min;加入PBS液500 μl混匀，1500 r/min离心5 min，弃上清。加入0.5 ml PBS充分混匀，悬浮细胞，4 h内流式细胞仪上机检测。

1.3.3 流式细胞检测:采用FACS Calibur流式细胞仪进行检测，应用CellQuest软件分析结果，在FSC-SSC散点图上选定淋巴细胞群，以CD4和SSC设门选择CD4阳性细胞分析CD25表达，分析其中CD4+/淋巴细胞、CD4+CD25+/淋巴细胞及 CD4+CD25+/CD4+比例。

1.4 统计学分析 使用SPSS17.0软件统计分析数据，两组间比较采用非参数检验中的两独立样本Mann-WhitneyU检验。数据结果以均数±标准差(珋x±s)表示，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果实验组与对照组比较，CD4+/淋巴细胞比例分别为(24.64+9.8)%和(31.72+6.6)%，两者比较差异无统计学意义(U=33.0，P=0.075)。CD4+CD25+/淋巴细胞比例分别为(4.05+3.7)%和(3.61+1.2)%，两者比较差异无统计学意义(U=51.5，P=0.575)。CD4+CD25+/CD4+的比例分别为(14.97+12.0)%和(11.27+2.8)%，两者比较差异无统计学意义(U=55.0，P=0.742)。

3 讨论HBV感染并发血小板减少狭义上是指ITP并发乙肝病毒感染，满足以下3个条件:①符合ITP的诊断;②HBV感染发生于血小板减少前或同时发现;③无门脉高压、脾大或肝硬化的证据(除外脾功能亢进引起的血小板减少)。广义上的HBV感染并发血小板减少应包括肝炎病毒感染后出现的、抗乙肝病毒治疗有效的血小板减少［5，9］。HBV感染并发血小板减少是临床常见血小板减少疾病之一，我们在临床工作中观察到抗乙肝病毒治疗能显著提高HBV感染并发血小板减少治疗效果。为进一步探讨其可能的发病机制，本研究首次比较了12例乙肝病毒感染并发血小板减少患者与10例健康体检者外周血中CD4+/淋巴细胞、CD4+CD25+/淋巴细胞及CD4+CD25+/CD4+比例，结果表明上述指标均未显示明显差异(P＞0.05)。

研究表明，慢性乙型肝炎患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞表达水平较正常人明显增高［10］，其机制可能与免疫耐受有关［11］。此外，ITP发病时外周血CD4+CD25+调节性T细胞表达水平较正常人明显降低［12］，其机制与免疫调节紊乱有关［13］。本研究结果显示CD4+CD25+调节性T细胞在HBV感染并发血小板减少患者外周血中比例与正常人无明显差异。本病既有HBV感染，又符合ITP的诊断，因此我们的研究结果表明可能是乙肝病毒感染相关免疫耐受与ITP相关免疫调节异常共同作用的结果，其发病可能存在较复杂的免疫紊乱。研究发现，经抗乙肝病毒治疗后慢性乙型肝炎患者外周血CD4+CD25+表达水平可逐渐下降，甚至恢复正常［14］。而经免疫调节治疗后，ITP患者外周血CD4+CD25+表达水平可明显升高，并可恢复正常［15，16］。因此，CD4+CD25+调节性 T 细胞在HBV感染并发血小板减少患者的表达水平与患者的病情、免疫状态，及与抗乙肝病毒治疗和免疫调节治疗的关系，值得进一步研究。