“双甲酸夹心”快速样本前处理方法的建立及在丝状真菌质谱鉴定中的初步应用*

苍金荣，王 翠，王 曦，陈 苗，魏喆敏，张利侠，马 娟，李 玲

(1.陕西省人民医院检验科，西安 710068；2.西安市红会医院，西安 710054)

临床上，丝状真菌感染常发生在肿瘤、艾滋病、恶性血液病、器官移植、透析、糖尿病、大面积烧伤、创伤等患者。丝状真菌感染对人体危害严重，治疗困难，由其引起的血流感染和侵袭性肺部感染及其他器官感染往往是致命性的，而不同种属丝状真菌对抗真菌药物的敏感性不同，一些真菌对临床常用抗真菌药天然耐药，因此，实验室确定丝状真菌种属非常重要。过去丝状真菌实验室诊断主要依靠形态学，即培养观察菌落形态、菌丝、孢子及产孢结构的特点进行鉴定，这种方法费时长，一般需要数天甚至数周时间，且受检验人员专业技术水平限制，不能满足临床需要。

近年来临床实验室采用PCR，基因测序、MALDI-TOF质谱仪等先进的技术方法来鉴定丝状真菌，但是前两种方法实验成本高、技术复杂且费时，一般实验室难以开展；MALDI-TOF质谱方法基于质谱仪自带的数据库对培养的菌株蛋白质分子谱系分析来对微生物鉴定诊断，其鉴定正确度高，具有成本和技术优势及很高的应用价值[1]，已在一些大型实验室普遍应用。目前，应用布鲁克microflex LT MALDI-TOF质谱仪鉴定丝状真菌，其样本前处理没有统一规定的方法，该仪器推荐的是垂直旋转培养法，但整个前处理流程操作繁琐，费时较长，并存在实验室污染的安全隐患，为了解决这一实验室难题，作者摸索并创新性建立了布鲁克microflex LT MALDI-TOF质谱仪丝状真菌“双甲酸夹心”样本快速前处理方法并初步用于临床实验室丝状真菌的鉴定。

1材料与方法

1.1 菌株来源 以2017年1月～2018年3月陕西省人民医院门诊及住院患者的痰液、肺泡灌洗液、血液、引流液、胸腔积液、腹腔积液、穿刺液、关节液、耳道分泌物、皮屑、甲屑、组织等标本分离到的各种丝状真菌共158株为研究对象。

1.2 仪器与试剂 microflex LT MALDI-TOF质谱仪及配套器材购自Bruker 公司；分离培养基有沙保弱琼脂平板、营养血琼脂平板、麦康凯平板。

1.3 方法 在生物安全柜中，于96孔不锈钢靶板上用无菌微量吸头滴加1 μl甲酸，再选取培养基上生长的丝状真菌菌落(幼龄菌丝体最好)用蘸取少许甲酸溶液的无菌牙签挑取菌丝体与甲酸溶液混合，并进行充分研磨，待其自然干燥后在其表面再次滴加1 μl的甲酸溶液，干燥后再加1 μl基质液(仪器配套)，待干燥后即可上机检测，再与真菌数据库(或自建库)对质谱峰图进行分析比较，根据制造商提供的结果判定标准进行判断。采用形态学[2～4]和基因测序的方法确认质谱结果的正确性。

2结果采用“双甲酸夹心”样本快速前处理方法处理后经布鲁克microflex LT MALDI-TOF质谱仪鉴定的丝状真菌包括：黄曲霉菌复合群41株，烟曲霉菌38株，土曲霉菌4株，杂曲霉菌3株，构巢曲霉菌3株，黑曲霉菌5株，茄病镰刀菌、层生镰刀菌、串珠镰刀菌各1株，其他镰刀菌属2株，伞枝横梗霉3株，米根霉4株，红色毛癣菌31株，断发毛癣菌2株，指间毛癣菌1株，青霉菌属3株，尖端赛多孢菌2株，链格孢霉3株，康氏木霉1株，球毛壳菌3株，宛氏拟青霉1株，淡紫拟青霉2株，裂褶菌1株，红色单囊菌1株(自建库)，马尔尼菲篮状菌1株(自建库)，鉴定到种的占71.5%(113/158)，鉴定到属的占19.6%(31/158)，分值较低及未鉴定出来的占8.9%(14/158)(其中红色单囊菌和马尔尼菲篮状菌为自建库)。

3讨论真菌是广泛分布于自然界的一大类真核生物，目前已知的对人类有致病性的真菌有500余种。临床上感染的真菌除常见的假丝酵母菌属、隐球菌属外，一些原来对人畜不致病的真菌转而致病的情况屡屡发生。近年来，丝状真菌感染发病率居高不下，由其引起的感染造成的人体危害更为严重[5]。因此，早诊断、早治疗尤为重要。

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOF MS)是一种可用于检测大分子物质的“软电离”质谱分析技术。近年来，该技术在病原微生物尤其是细菌的研究中被证实是一种准确、快速、经济的检验方法[6～8]。随着MALDI-TOF MS 技术的不断完善和发展，其在致病性真菌研究中的作用也日显突出[9]。应用布鲁克microflex LT MALDI-TOF质谱仪鉴定丝状真菌，目前普遍的前处理实验操作方法是把培养基长出的真菌菌落挑取菌丝植入液体培养基在摇床上持续培养(1～2天)，然后经离心、洗涤、甲酸萃取等操作(耗时1 h左右)再上机鉴定，其操作步骤繁琐，费时费力。

笔者以布鲁克microflex LT MALDI-TOF质谱仪器为平台，建立了“双甲酸夹心”样本快速前处理方法，具有以下优势：①操作简单： 此操作过程到检出结果仅需要10多分钟，与目前该质谱仪推荐的鉴定前处理样本的繁琐实验操作步骤相比较，缩短了实验流程，具有省时、高效、极低实验成本，减少原方法在样本培养及处理过程中可能的实验室污染和产生的生物安全隐患。②早期鉴定：传统的形态学鉴定方法依靠培养后菌落生长速度、形态、颜色等特征以及镜下形态特点和产孢方式进行鉴定，需要检验人员有丰富的丝状真菌鉴定经验，另外丝状真菌生长缓慢，通常需要数天甚至数周才能呈现较明显的菌落菌体特点；国外文献报道MALDI-TOF质谱仪样本前处理推荐的甲酸提取法在菌株培养到5天时鉴定结果较好，鉴定率可达85.9%[10]。但以上方法均耗费时间较长，患者往往已经错过了最佳治疗时间。我们新建立的“双甲酸夹心法”对于培养基上早期生长的真菌菌落(幼龄菌丝体最佳)就可以进行快速前处理上机鉴定，操作简便快速，大大缩短了鉴定时间。使用“双甲酸夹心法”在菌落生长2天鉴定结果最好，鉴定到种属的几率最高。③对培养基没有特殊选择：即任何培养基生长的丝状真菌都可用该方法处理后上机鉴定。④鉴定效果好：能鉴定到种属的菌株高达91.1%，且对形态不典型或少见的丝状真菌都能正确鉴定到种，如白色烟曲霉菌、白色土曲霉菌、球毛壳菌、普通裂褶菌、尖端赛多孢菌、红色单囊菌、马尔尼菲篮状菌等。

从我们实验研究和初步临床应用来看，布鲁克microflex LT MALDI-TOF质谱仪丝状真菌鉴定“双甲酸夹心”样本快速前处理方法具有较高的推广应用价值。

参考文献：

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