肠道菌群检测技术的研究进展

2018-02-09徐海洋叶文广

智慧健康 2018年32期

徐海洋，叶文广

（1.江苏省泰兴中学,江苏泰兴 225400；2.浙江省台州医院,浙江台州 317000）

1 肠道菌群概述

人类与多达1014种微生物有共生关系。这些与宿主相关微生物中的大多数存在于胃肠道内并具有很强的代谢能力，在人类健康中起关键作用。肠道微生物组增强宿主对病原体入侵的抵抗能力，调节宿主基因表达和免疫反应并最终影响整体健康。胃肠道的正常定居菌群可以促进宿主消耗多糖，微生物群内微生物之间的相互作用增强了这种代谢能力，进一步提高了多糖的利用率。肠道微生物还有许多其他的功能，例如通过免疫系统调节以保护机体，抵抗疾病，以长双歧杆菌为例，其可以强烈刺激白细胞介素-10和促炎细胞因子的产生，同时可以保护宿主免受因肿瘤增殖而产生TNF-α因子的损害。此外，双歧杆菌和其他乳酸菌通常产生胞外多糖（LPS）复合聚合物，可用作其他肠道微生物的可发酵底物，有助于维持微生物群落结构并增强菌群稳定性。

微生物群的失调（dysbioses）与很多疾病相关，包括肥胖，糖尿病，结肠直肠癌和过敏。因此，维持肠道微生物组的组成和功能稳定性对于宿主健康至关重要，例如在克罗恩病当中，肠道微生物组当中的有益双歧杆菌科中显着减少。肠道菌群的失调同时表现出含有潜在病原体的群体增加，包括肠杆菌科，巴斯德菌科，梭杆菌科和奈瑟菌科等。

目前的高通量测序技术提供了关于肠道微生物组的组成和功能的重要信息。然而，为了更好地理解肠道微生物群与其宿主之间的相互作用机制，以及肠道微生物组在维持健康方面的作用，生物学和工程学的多个分支的新兴技术正在逐步整合，以更好地对肠道进行进行研究。本文将讨论微生物组研究的新突破，从分离培养、测序技术、粪便分析方法、分选细菌的技术等方面展开综述，这些新的研究可以提高我们未来研究肠道微生物组的能力[1]。

2 肠道菌群检测的新技术

随着基因测序技术的快速发展，人们对肠道菌群的研究逐渐深入，肠道菌群这一“人体第二基因组”逐渐揭开了面纱。肠道菌群种类多且数量惊人并且功能丰富。主要的菌种为厚壁菌和拟杆菌还有变形杆菌。在人的不同年龄阶段，肠道菌群的种类和数量有着不同的特征，处于“年龄相关”的动态增长状态。接下来，我们将讨论微生物组检测技术领域研究的新突破，从分离培养、测序技术、粪便分析方法、分选细菌的技术等方面展开综述，这些新的研究可以提高我们未来研究肠道微生物组的能力。

2.1 细菌培养分离方法

细菌培养方法是最传统的细菌研究方法，利用各种选择培养基对胃肠道细菌进行培养，通过倍比稀释和菌落计数来测定菌落数量。本方法最传统，最常用，但是局限性也非常的大。自然界中超过九成的细菌并不适用于此方法，主要是这些微生物有许多是严格厌氧菌，在实验室中很难培养出来。对于种类繁多、数量庞大的肠道微生态系而言，只对部分菌群进行分析不够全面，也不能反映整个微生态系与疾病发生发展的关系，分析的结果与结论便存在一定局限性。

但是最新研究发现，混合培养这一技术有望突破目前细菌分离培养出现的难题。目前，纯培养到混合培养的转变主要依赖于三项技术的进步：微流体技术，下一代3D生物打印，单细胞代谢组学，未来，这些技术的进步有望实现三种及以上微生物的系统性大规模共生培养研究[2]。

2.2 测序方法

下一代测序（NGS）技术的发展使研究人员能够从更广泛和更深入的角度去研究和了解微生物世界。现当代DNA测序技术的进步不仅能够更精细地表征细菌基因组，而且还可以帮助研究者对复杂微生物组进行更深入的分类学鉴定，其基因组本质是定植在消化道内的微生物的组合遗传物质。迄今为止，16S-rDNA测序，宏基因组学和宏转录组学是用于微生物组的分类学鉴定和表征的三种基本测序策略。这些测序策略使用不同的NGS平台进行DNA和RNA序列鉴定。传统上，16SrDNA测序在理解微生物组的分类组成方面发挥了关键作用。最近，宏基因组方法通过提供物种水平、菌株水平的表征从而使得人们对微生物组有了更好的理解。此外，宏转录组学方法有助于单个微生物组内不同微生物群落之间复杂相互作用的功能表征。但是现在的测序方法还存在不少的问题，我们可以通过提升样品中核酸的质量和数量、测序中使用合适的阳性及阴性对照以更好地改善基于NGS的菌群研究。测序技术本身也在高速发展中，未来，单分子长时间读取测序SMRT、HeliScope、MinION等第三代测序（TGS）平台在未来可能用于菌群检测，这些新技术会加快菌群研究的脚步[3]。

2.3 粪便样品的分析方法

现有的研究技术已经可以对菌群的基因组进行测序，那么快速、安全、方便的提取粪便样品中的遗传物质便成为了研究者、医生、检验员所面临的问题。获得最大数量的未被物理或化学降解的DNA样品的关键在于采用合适的提取手段。目前提取粪便样品的方法很多，我们介绍一种最新的粪便分析方法。

目前，方便，可重复和快速保存独特的生物标本是微生物组分析中所面临的关键问题。随着越来越多的人体研究将肠道微生物组纳入其设计中，迫切需要简化样品采集和储存方法，同时对DNA产物的质量有了更高的要求，以满足不同的设置和实验需求。下面介绍一种用于储存和二次取样的粪便样品处理的方法——粪便分吸管技术（FAST）。该方法使用吸管从最近排出或保存在低温但未冷冻（即4℃）的样品中收集粪便物质。FAST处理的样品可以在超低温下长时间有效储存，可在不解冻的情况下轻松进行二次取样，并需要最少的供应和存储空间，在实验室和现场使用都很方便。将分离产生的菌株接种到无菌小鼠中，该操作平均保留了80%的供体菌落。

总的来说，FAST允许重复的二次取样而不需要解冻样品，并且需要很少的粪便供应量和储存空间，使得在实验室和现场使用都很方便[4]。

2.4 微流控技术

前文所述的技术主要是针对于微生物组整体特征的研究，但是对于微生物组中个体的研究目前还比较困难，主要难点是如何专门探究单个菌株的特征性质。微生物细胞在菌落中会表现出不同的特征，然而目前的对微生物组的标准研究方法仅仅可以呈现出异质群体的平均特征，并且缺乏在单个细胞水平上分析微生物的精准度。此外，胃肠道微生物组不同于实验室环境下的纯菌落环境，而是存在于复杂的群落中。因此，最理想的研究单个菌株的方法是在保持其自然环境的同时还可以观察到单个细胞水平上的微生物。传统的“稀释-培养方法”能够将菌群的复杂性降低到最小的生态功能单元，但是对于单个菌株的研究还是不够准确。最近，微流控作为一种新技术正在引起研究者的关注，大家期待这种新技术能应用于各种单细胞的研究，因为它有能力处理微结构中纳米级体积的结构，为观察单个微生物细胞提供了有吸引力的替代方案。微流控技术通过微流控芯片和细胞捕获实现对微生物单个细胞的追踪观察，现有的微流控（芯片）装置可以分为连续流动装置、微液滴装置、试纸装置和数字微流控装置等四类；目前可以使用流体陷阱、微孔播种、电势陷阱、微液滴包装和光学陷阱等方法捕获单细胞，从而在单细胞层面实现追踪和持续监测；连续微流体已用于微生物单细胞培养，全基因组测序，基因表达和代谢分析；结合微流控可以实现单细胞水平上的基因测序、表达谱分析、代谢分析和疾病筛查等，具有十分光明的应用前景[5]。

2.5 流式细胞术

上文所述的微流控技术为研究单个细胞提供了可能，下面就介绍一种可以分离某种特定菌株的方法——流式细胞术。流式细胞术是一种分离筛选细胞的手段，我们从微生物细菌的本质出发——微生物细菌也是细胞，因此也可以用流式细胞术进行分选。经典的微生物学分离培养技术是益生菌计数的金标准。然而，这些技术受到时间，特异性等限制，无法检测活的但不可培养的（VBNC）微生物和无活力细胞，现在有研究利用流式细胞术去量化某种特定益生菌，这为定量研究特定菌株提供了可能。研究者针对来自不同物种的五种益生菌菌株（双歧双歧杆菌R0071，长双歧杆菌ssp.infantis R0033，长双歧杆菌ssp.longum R0175，瑞士乳杆菌R0052和鼠李糖乳杆菌R0011）制备了多克隆抗体。操作员利用两种流式细胞仪进行了分析，并与使用选择性培养基的经典微生物学培养进行了比较。结果表明，流式细胞仪提供的细胞计数高于传统的微生物学细胞计数（P＜0.05），同时两种方法均获得了等效性能（重复性和再现性）。该研究表明，流式细胞术方法可用于益生菌计数和活力评估。与传统技术相比，流式细胞仪可在极短时间（＜2h）内对存活和不存活的益生菌菌株进行绝对和特异性定量，为研发和质量控制提供了有效的工具[6]。