高血压小鼠动脉血管平滑肌细胞PI3K/Akt/SREBP1信号活化及表型转化研究

韩阳 高登峰 李明军 倪亚萍

心血管疾病是全世界成人的首要致死因素，而高血压是心血管疾病中最重要的危险因素[1]。研究显示，2002年至2012年间，我国高血压患病率每年增加1.4%，且北方人群患病率高于南方人群[2]。持续性高血压可诱导血管重塑及血管功能不全，改变血管壁胞外基质成分，同时诱导血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）表型转化[3,4]。在血管重塑过程中，位于血管壁中间层的VSMC生长、增殖和迁移，同时合成大量细胞外基质[5]。固醇调节元件结合蛋白1（sterol regulatory elementbinding protein 1，SREBP1）是细胞内重要的转录因子，参与调控细胞内脂质代谢平衡[6]。研究发现，SREBP1介导了VSMC细胞内胆固醇累积进而影响细胞正常功能，同时脂质代谢失衡也改变VSMC细胞行为，诱导细胞增殖和迁移[7,8]。因此，我们猜测高血压是否能够通过影响VSMC内SREBP1的表达，进而改变细胞表型、诱发血管重塑。本研究利用高血压动物和细胞模型，探索SREBP1在VSMC表型转化中的作用，以期为高血压治疗提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 8周龄雄性C57BL/6J小鼠购自国家实验动物种子中心，饲养于恒温［（20±2）℃］、恒湿［（55±5）%］动物房中，12/12 h光周期，自由饮水、摄食。

1.1.2 试剂 血管紧张素Ⅱ（AngiotensinⅡ，AngⅡ）、缬沙坦、辣根过氧化物酶标记的第二抗体购自美国Sigma-Aldrich公司，苏木素-伊红染色液、聚偏氟乙烯膜（PVDF）、LY294002购自江苏碧云天公司，LipofectamineTM2000、Trizol试剂、反转录试剂盒、ECL试剂盒购自美国Thermo Fisher公司，SYBR PremixEx TaqⅡ购自大连宝日医公司，第一抗体包括SREBP1抗体、Akt抗体、磷酸化Akt p-Akt抗体、α平滑肌肌动蛋白α-SMA抗体、骨桥蛋白OPN抗体、β-actin抗体购自美国Novus Biological公司，其余常见试剂均为国产。

1.2 方法

1.2.1 动物分组处理 将50只C57BL/6J小鼠随机分为对照组、处理组1、处理组2、处理组3和缬沙坦组，每组10只。小鼠预先通过手术于背部皮下植入微渗透泵，处理组小鼠通过微渗透泵按照150 ng·kg-1·min-1（处理组1）、300 ng·kg-1·min-1（处理组2）、600 ng·kg-1·min-1（处理组3）的速率灌注AngⅡ（溶于0.9%生理盐水），缬沙坦组小鼠按照600 ng·kg-1·min-1的速率灌注 AngⅡ，对照组小鼠则通过微渗透泵灌注生理盐水，共处理28 d。缬沙坦组小鼠在灌注AngⅡ的同时通过灌胃方式给予40 mg·kg-1·d-1缬沙坦进行处理，对照组和处理组则灌注等体积蒸馏水。称量小鼠体质量，并检测小鼠心率和血压变化。

1.2.2 苏木素-伊红（HE）染色 取小鼠主动脉根部至主动脉弓血管，在中性甲醛溶液中进行固定，石蜡包埋后制成5 μm厚切片，将切片脱蜡至水后用苏木素染液处理10 min，0.5%盐酸乙醇处理10 s后伊红染色5 min，梯度乙醇脱水、二甲苯透明，中性树脂封片，显微镜下观察。

1.2.3 VSMC细胞分组处理 将VSMC细胞随机分为正常组、处理组1、处理组2、处理组3、缬沙坦组、LY294002组、沉默对照组、沉默组。处理组细胞分别添加 0.1×10-6mol/L（处理组 1）、0.5×10-6mol/L（处理组 2）、1.0×10-6mol/L（处理组 3）AngⅡ处理24 h，缬沙坦组则在添加 AngⅡ（1.0×10-6mol/L）处理前用 1.0×10-6mol/L缬沙坦预处理 6 h，LY294002组在 AngⅡ（1.0×10-6mol/L）处理前用10 ng/ml LY294002预处理6 h，沉默对照组和沉默组细胞在AngⅡ（1.0×10-6mol/L）处理24 h前转染scramble siRNA和SREBP1 siRNA，正常组添加等体积溶媒处理。

1.2.4 siRNA转染 查找SREBP1基因序列（NM_011480.4），设计含BamⅠ和 HindⅢ酶位点的siRNA引物并合成siRNA，其中SREBP1 siRNA上游引物为 5′-GAT CCG ACA TGC TCC AGC TCA TCA TTC AAG ACG TGA TGA GCT GGA GCA TGT CTT TTT TGT CGA CA-3′，下游引物为 3′-GCT GTA CGA GGT CGA GTA AGT TCT GCA CTA CTC GAC CTC AAA AAA CAG CTG TTC GA-5′，产物长度65 bp，由华大基因合成。将扩增产物克隆到shRNA质粒中并测序鉴定。VSMC细胞生长至80%融合时用于转染，取5 μl LipofectamineTM2000稀释到250 μl减血清MEM培养基，室温下孵育5 min后加入8 μl siRNA，室温共孵育20 min。将混合后的siRNA-Lipofectamine复合物加入到VSMC细胞培养孔中，轻轻摇动混匀，37℃、5%CO2条件下进行培养。

1.2.5 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析 利用Trizol试剂提取小鼠主动脉总RNA，反转录试剂盒合成cDNA第一链作为qRT-PCR模板（10 μl反应体系）。qRT-PCR 扩增体系（20 μl），包含上、下游引物各 0.5 μl，SYBR PremixEx TaqⅡ10 μl，模板 2 μl，ddH2O 7 μl。qRT-PCR 扩增条件：95 ℃ 2 min，94 ℃20 s，60℃ 20 s，40个循环；溶解曲线温度 65℃～95 ℃。SREBP1（NM_011480.4）引物：上游 5′-GTA CCT GCG GGA CAG CTT AG-3′，下游 5′-GTC CAT TGC TGG TAC CGT GA-3′，产物长度 161 bp。β-actin（NM_007393.5） 引物：上游 5′-CCT AAG AGG AGG ATG GTC GC-3′，下游 5′-CTC AGA CCT GGG CCA TTC AG-3′，产物长度 155 bp。根据PCR反应得出的循环阈值（cycle threshold value，Ct），由 2-ΔΔCt公式计算目的基因相对表达量。

1.2.6 免疫印迹检测 取小鼠主动脉或VSMC细胞，添加 RIPA 裂解液［50 mM Tris（pH 7.4），150 mM氯化钠，1%Triton X-100，1%去氧胆酸钠，0.1%SDS，0.1 g/L PMSF］提取总蛋白，利用 Braford法测定蛋白浓度。取40 μg蛋白上样，SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白。电泳结束后将蛋白通过湿法转移至PVDF上，随后将PVDF膜用5%脱脂奶粉在室温下封闭2 h。T-PBS漂洗3次，添加第一抗体在4℃中封闭过夜。本研究使用的第一抗体包括SREBP1抗体（1∶1000）、Akt抗体（1∶1000）、p-Akt抗体（1∶800）、α-SMA 抗体（1∶1000）、OPN 抗体（1∶1000）、β-actin抗体（1∶1000）。T-PBS漂洗 3次，添加辣根过氧化物酶标记的第二抗体（1∶5000）于37℃孵育2 h，ECL试剂盒显影，利用Image J软件检测灰度值，计算相对表达量。

1.3 统计学方法 利用SPSS 13.0统计软件进行统计分析。所有数据均采用±s的方式表示，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），并利用SNK－q检验进行两两比较。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 高血压小鼠体质量、心率、收缩压、舒张压变化 与对照组比较，各处理组和缬沙坦组小鼠体质量、心率水平无明显变化（P＞0.05）。处理组1、处理组2和处理组3小鼠收缩压和舒张压水平明显高于对照组（P＜0.05）。缬沙坦组收缩压和舒张压水平低于处理组（P＜0.05），但高于对照组（P＜0.05）。见表1。

表1 高血压小鼠生理指标检测（±s）

表1 高血压小鼠生理指标检测（±s）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与处理组 1、2、3 组比较，bP＜0.05

舒张压（mm Hg）对照组 10 25.8±2.7 532.9±46.7 121.4±11.8 69.3±5.5处理组 1 10 24.3±3.6 541.2±50.1 132.4±12.7a 74.6±6.3a处理组 2 10 25.1±2.9 544.8±48.4 141.7±12.9a 82.1±4.9a处理组 3 10 24.8±3.5 546.5±47.3 149.6±11.5a 90.3±7.9a缬沙坦组 10 25.6±4.1 542.9±45.6 134.9±13.4ab 75.3±6.8ab组别 例数 体质量（g）心率（次/min）收缩压（mm Hg）

2.2 高血压小鼠主动脉血管形态学观察 与对照组比较，处理组小鼠主动脉血管壁增厚、管腔增大，血管重塑明显。缬沙坦抑制血管重塑改变。见图1。

2.3 高血压小鼠主动脉血管SREBP1 mRNA和蛋白表达水平检测 3个处理组主动脉血管SREBP1 mRNA水平均显著高于对照组（P＜0.05），而缬沙坦组主动脉血管SREBP1 mRNA明显低于处理组（P＜0.05）而高于对照组（P＜0.05）。SREBP1蛋白表达水平与mRNA的表达水平一致。见图2～4。

2.4 小鼠动脉VSMC细胞SREBP1蛋白水平检测相比于正常组，处理组细胞SREBP1蛋白水平明显上升（P＜0.05）。缬沙坦组细胞SREBP1 mRNA水平低于处理组2和处理组3（P＜0.05），与处理组1无显著差异（P＞0.05），同时高于正常组（P＜0.05）。见图 5、6。

2.5 VSMC细胞PI3K/Akt信号影响SREBP1表达与正常组比较，处理组细胞磷酸化Akt水平明显增高（P＜0.05），缬沙坦组细胞磷酸化Akt水平则低于处理组 （P＜0.05） 而高于正常组 （P＜0.05），LY294002组磷酸化Akt水平明显低于正常组（P＜0.05）。与正常组比较，LY294002组SREBP1表达水平也明显降低（P＜0.05）。见图 7、8。

2.6 VSMC细胞SREBP1参与VSMC表型转化 与正常组及沉默对照组比较，SREBP1 siRNA显著降低VSMC细胞SREBP1蛋白表达水平（P＜0.05）。与正常组比较，处理组细胞α-SMA表达明显降低而OPN表达则升高（P＜0.05），缬沙坦组细胞α-SMA表达高于处理组而OPN低于处理组；同时LY294002组和沉默组α-SMA表达均高于处理组和缬沙坦组，而OPN表达则降低（P＜0.05），与正常组无明显差异。见图9、10。

3 讨论

肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin，RAS）是诱导高血压和心血管疾病的关键性因素。AngⅡ是RAS的效应物，刺激细胞的AT1R受体诱导不良心血管反应，如降低组织血供、血压升高、钠潴留、内皮功能不全和纤维化等[9]。本研究建立了AngⅡ处理小鼠高血压模型，通过HE染色观察到高血压小鼠模型主动脉血管壁增厚，发生血管重塑，缬沙坦处理则可逆转AngⅡ的作用。李洋等[10]发现，低剂量 AngⅡ（100 ng·kg-1·min-1）仅诱导小鼠血管重塑，但不影响小鼠舒张压和收缩压，高剂量AngⅡ（400 ng·kg-1·min-1）则可影响小鼠血压和血管重塑。本实验中低剂量组使用药物剂量相对较高（150 ng·kg-1·min-1），同时观察到小鼠血压和血管变化。

在正常细胞中，SREBP1位于内质网膜内并与SREBP裂解激活蛋白结合，当细胞固醇含量降低时，SREBP1释放至高尔基体中酶解修饰，随后进入细胞核中调控靶基因表达[6]。有研究也发现，SREBP1的表达与多种肿瘤如胰腺癌、子宫内膜肿瘤、卵巢癌等恶性肿瘤细胞的生长有关[11-13]。本研究发现，小鼠主动脉血管及VSMC细胞中SREBP1的表达水平随着AngⅡ处理剂量增加而增高，并且其表达能被缬沙坦降低，说明了AngⅡ具有通过AT1R受体调节SREBP1表达的作用。AT2R是细胞中AngⅡ的另一个受体，其活化具有抑制VSMC生长的作用，需要进一步实验证明AngⅡ是否也通过AT2R调控下游SREBP1的表达。

本研究利用PI3K特异性抑制剂LY294002处理VSMC细胞，细胞中磷酸化Akt的表达水平降低，证明LY294002可阻断PI3K/Akt信号在细胞中转导。缬沙坦也可抑制PI3K/Akt信号活化，证明AngⅡ活化PI3K/Akt途径是通过VSMC细胞中AT1R受体。与此同时，SREBP1的表达受到抑制，说明AngⅡ对SREBP1的调控依赖于PI3K/Akt信号途径。磷酸化的Akt可通过两条途径调控SREBP1活性：①Akt通过下调泛素化酶Fwb-7的表达稳定细胞核SREBP1蛋白，促进其靶基因的表达；②Akt可通过mTORC1调节SREBP1向细胞核转移[6]。

在正常生理条件下，VSMC细胞呈现高度分化、低增殖性的收缩型表型。受到外界刺激后，如生长因子、丝裂原、炎症介质和机械力作用，VSMC则可能丢失收缩型表型，开始生长、分裂、迁移，同时合成大量细胞外基质[14]。α-SMA是收缩型VSMC的标志蛋白，而OPN则是非收缩型（合成型）VSMC的标志蛋白。本研究发现，AngⅡ处理可下调VSMC细胞中α-SMA的表达而上调OPN的表达，缬沙坦和LY294002则可拮抗AngⅡ的作用，从而验证了AngⅡ在VSMC表型转化中的作用机制。此结果通过转染SREBP1 siRNA直接敲低VSMC细胞中SREBP1的表达而进一步得到证明。研究发现，SREBP1能够直接与TGF-β启动子区结合启动基因表达，从而改变细胞外基质成分和结构[15]。因此，SREBP1可能直接影响VSMC细胞外基质而促进表型转化。

综上所述，AngⅡ诱导高血压小鼠主动脉血管重塑和VSMC表型转化，其中PI3K/Akt/SREBP1途径介导了AngⅡ在VSMC表型转化中的作用，从而可能为治疗高血压及相关的血管病变提供新的靶点。

高血压小鼠动脉血管平滑肌细胞PI3K/Akt/SREBP1信号活化及表型转化研究 P79

图1 各组高血压小鼠主动脉重塑变化（标尺 50 μm）

图2 高血压小鼠主动脉血管SREBP1 mRNA表达水平检测

图3 高血压小鼠主动脉血管SREBP1蛋白免疫印迹条带

图4 高血压小鼠主动脉血管SREBP1蛋白相对表达水平

图5 各组VSMC细胞SREBP1蛋白免疫印迹条带

图6 各组VSMC细胞SREBP1蛋白相对表达水平

图7 各组VSMC细胞磷酸化Akt和Akt蛋白免疫印迹条带

图8 各组VSMC细胞磷酸化Akt相对表达水平

图9 各组VSMC细胞α-SMA和OPN蛋白免疫印迹条带

图10 各组VSMC细胞α-SMA和OPN蛋白相对表达水平

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