基于二硫化钼固态纳米孔检测DNA分子实验研究

尉 玉 蔺卡宾 沙菁 张 艳 陈云飞

(东南大学江苏省微纳生物医疗器械设计与制造重点实验室, 南京 211189)(东南大学机械工程学院, 南京 211189)

近年来,固态纳米孔和生物纳米孔被广泛应用于生物分子检测,基于纳米孔的DNA测序方法最早由Kasianowicz等[1]提出,其原理是通过纳米孔连接纳米孔两侧的电解质溶液,使用膜片钳放大器在纳米孔的两侧施加恒定电压,从而产生一个恒定的基准离子电流,通过电泳驱动带负电的DNA分子纳米孔[2].DNA分子在纳米孔内的物理占位造成纳米孔通道内的电阻变化,引起离子电流的变化,形成表示生物分子特性的过孔信号.通过分析过孔信号的幅值大小、驻留时间,就可区分相应生物分子的直径、长度、形态,甚至区分DNA的4种碱基(A,C,G,T)[3-4].

相比生物纳米孔,固态纳米孔更方便大规模集成制造,具有良好的稳定性、形态可控、便于与纳米器件进行装配等优势[5],但由于受到纳米孔直径和厚度的制约以及难以控制纳米孔表面电荷分布,传统固态纳米孔相对于生物纳米孔的灵敏度较低[6].提高检测灵敏度的一个有效方法是减小纳米孔薄膜的厚度,可以在不增加噪音的基础上同时增大基准离子电流和信号幅值,从而提升信噪比[7].

普通氮化硅纳米孔的厚度约为10～20 nm,远大于单个碱基的尺寸,因此提出可使用具有原子级厚度的二维材料进行DNA测序[8],如石墨烯为单层碳原子,厚度大约为0.34 nm,与单个碱基的尺寸相当.文献[9-12]先后验证了石墨烯用来制备纳米孔进行DNA检测的可行性.但是利用石墨烯纳米孔测序存在石墨烯和DNA分子间的强相互作用[13]使DNA分子吸附在石墨烯表面的问题,因此必须采用表面修饰[11]、原子层沉积[10]来弱化表面的作用.

相比石墨烯,虽然单层MoS2厚度约为0.65 nm,大于石墨烯,但由于单层MoS2具有直接带隙和优异的场效应性能[14],故MoS2纳米孔可用于DNA等生物分子的检测.单少层的MoS2可以通过机械剥离、化学气相沉积[15]等方法获得,因此为了深入探究MoS2纳米孔在DNA分子检测中的性能以及影响因素,本文通过机械剥离和转移相结合方法将MoS2薄膜覆盖在Si3N4孔上,对最终制备的MoS2纳米孔进行一系列的实验研究.

1 实验原理和方法

1.1 实验原理

图1为实验装置图,通过纳米孔相连两侧溶液池,使用Axon膜片钳放大器在溶液的两端施加电压,从而形成基准离子电流.由于λ-DNA带负电,将DNA加入左侧负极的液池中,在电泳驱动下DNA分子将会向正极移动,DNA分子通过纳米孔时,由于物理占位将会导致基准离子电流的下降,并产生相应的过孔时间,通过分析阻塞离子电流的幅值和时间,可以分析得到DNA分子的运动情况.本实验所采用Takara公司生产的双链λ-DNA,共有48.5 kbp,长度约为17 μm,直径约为2.2 nm,所用溶液为含有浓度为1 mmol/L EDTA和10 mmol/L Tris的缓冲液,pH=8.0的氯化钾溶液,实验过程中将DNA溶液浓度稀释为2 μg/mL,采用的电极是Ag/AgCl电极,膜片钳为Axon,采样频率为10 kHz.

图1 实验装置示意图

1.2 纳米孔的制备

用MoS2纳米孔制备过程如下:

① 首先通过低压化学气相沉积技术(LPCVP)在大小为2.5 mm×2.5 mm×0.43 mm的硅基底两侧各沉积一层厚度为100 nm的Si3N4薄膜;在一侧氮化硅基底上释放一个正方形窗口,再通过湿法刻蚀技术在硅基底上不断刻蚀正方形深槽直至形成100 μm×100 μm的悬空氮化硅薄膜,如图2(a)所示.

② 在Si3N4薄膜的中心处通过光离子束刻蚀的方法加工出1 μm左右大小的微米孔,如图2(b)所示.

③ 通过机械剥离(多次用胶带粘取)的方法制备单少层MoS2样品到氧化硅基底上,在光学显微镜下观察寻找单少层MoS2,并记录位置和大小,如图2(e)所示.图中，MoS2样品的厚度约为5层,大小为4 μm×8 μm,之后在氧化硅基底上均匀涂上聚碳酸亚丙酯胶(0.125 g/mL,溶剂为丙酮).

④ 将聚碳酸亚丙酯薄膜加热固化,薄膜会吸附着MoS2样品,将薄膜取下,置于转移台的微观操作手载玻片下方的聚二甲基硅氧烷缓冲层上;通过微观操作手操作,将单少层MoS2样品对准覆盖在氮化硅芯片1 μm大小的孔上,如图2(c)所示.然后通过微观操作手压紧.加热氮化硅芯片至220 ℃,待聚碳酸亚丙酯薄膜液化,用丙酮去除氮化硅芯片上面残余的聚碳酸亚丙酯.

⑤ 用聚焦离子束在MoS2薄膜的中心区域加工出20～50 nm的MoS2纳米孔,如图2(f)所示.

(a) 氮化硅薄膜

(b) 刻蚀出1 μm的孔

(c) 将MoS2转移到孔上

(d) FIB加工出MoS

2

纳米孔

(e) 单少层MoS2样品

(f) 转移完成后SEM

图2 MoS2纳米孔的制备过程

普通氮化硅纳米孔的制备只需在步骤①的基础上,在氮化硅薄膜的中心区域1 μm×1 μm的正方形内,通过离子束刻蚀技术(FIB)将薄膜减薄至10 nm左右,在减薄区域用FIB加工出一个30 nm左右的纳米孔.

为去除芯片表面杂质,以免影响基准离子电流,Si3N4芯片在打孔前和打孔后都需要用150 ℃的食人鱼溶液(体积比V(H2SO4)∶V(H2O2)=3∶1)浸泡20 min,再用去离子水清洗3遍,最后用氮气吹干.转移完成制备的MoS2纳米孔需要先后用丙酮、无水乙醇和去离子水清洗,并用高纯氮气吹干,最后用Plasma进行表面等离子处理.

2 实验结果和讨论

2.1 不同电压对DNA通过MoS2纳米孔的影响

(a) MoS2纳米孔SEM图

(b) MoS2拉曼光谱图

(c) 1 mol/L KCl溶液中的电流-电压曲线图

(1)

式中,σ为KCl溶液的电导率;L为MoS2薄膜的厚度;d为纳米孔的直径.1 mol/L KCl溶液的电导率σ=10.2 S/m;MoS2薄膜为5层,L=3.2 nm,纳米孔直径d=30 nm,将以上参数代入式(1)得到纳米孔的电导G≈248 nS,该值接近于实验值252 nS.

400,500和700 mV三种电压下所检测的DNA分子通过纳米孔时造成的堵塞离子电流幅值和过孔时间散点分布图如图4(a)所示.可以看出,3种电压下幅值区分较为明显.图4(b)～(d)是3种电压下统计的阻塞离子电流幅值分布和Gauss分布峰值拟合图.400 mV电压时阻塞离子电流峰值约为1.27 nA,500 mV时约为1.77 nA,700 mV电压时阻塞离子电流峰值增加到2.79 nA,可以发现随着电压的升高,阻塞离子电流幅值也在增加.采用归一化的标准幅值比ΔI/I0来进行对比,其中I0为基准离子电流；ΔI为阻塞离子电流幅值，如图4(e)～(g)所示,电压从400 mV上升到700 mV时,ΔI/I0从0.016 9提高到0.022 9.标准幅值比ΔI/I0由DNA在MoS2纳米孔中的空间占位大小所决定,空间占位越大,标准幅值比越大,也即电导的变化率增大.ΔI/I0的增大表明,随着电压的升高,DNA在受限空间内和纳米孔之间的相互作用变强,使得DNA在纳米孔中的空间占比增大,DNA更倾向于以非折叠形式转变为折叠形式过孔.

(a) 堵塞离子电流幅值和过孔时间散点分布图

(b) 400 mV幅值分布图

(c) 500 mV幅值分布图

(d) 700 mV幅值分布图

(e) 400 mV幅值比分布图

(f) 500 mV幅值比分布图

(g) 700 mV幅值比分布图

(h) 400 mV过孔时间分布图

(i) 500 mV过孔时间分布图

(j) 700 mV过孔时间分布图

图4(h)～(j)是DNA分子在3种电压下通过MoS2纳米孔时间的分布及峰值拟合图.400 mV电压时过孔时间峰值约为0.427 7 ms,500 mV电压时过孔时间峰值减小到0.389 0 ms,而当电压为700 mV时过孔时间峰值约为0.231 8 ms.可以发现随着电压的升高,DNA分子通过纳米孔的过孔时间随之降低.随着电压的升高,DNA分子通过MoS2纳米孔所造成的离子电流幅值增加,过孔时间减少,说明电压升高,驱动力提高,DNA分子的过孔速度更快.

2.2 溶液浓度对DNA通过MoS2纳米孔的影响

改变溶液浓度,分别使用浓度为0.1,0.5和1.0 mol/L的KCl溶液进行实验,施加800 mV电压,对DNA分子的过孔时间和幅值进行对比.

图5(a)为标准幅值比ΔI/I0和过孔时间散点分布图,阻塞离子电流幅值和标准幅值比的分布如图5(b)～(g)所示.从图中可以看出,随着浓度的降低,阻塞离子电流幅值峰值从1.93 nA降低到0.72 nA,但是标准幅值比ΔI/I0的峰值却从0.012 2提高到0.023 8.孔内离子电流计算公式[17]为

(a)ΔI/I0和过孔时间散点分布图

(b) 1.0 mol/L幅值分布图

(c) 0.5 mol/L幅值分布图

(d) 0.1 mol/L幅值分布图

(e) 1.0 mol/L幅值比分布图

(f) 0.5 mol/L幅值比分布图

(g) 0.1 mol/L幅值比分布图

(h) 1.0 mol/L过孔时间分布图

(i) 0.5 mol/L过孔时间分布图

(j) 0.1 mol/L过孔时间分布图

(2)

ΔI=ΔGΔV

(3)

(4)

式中,ΔV为施加电压;ΔG为电导变化量.ΔI/I0可以等价于ΔG/G,当KCl溶液浓度在0.1～1.0 mol/L范围内时,孔内电导G近似呈线性增长[18],因此基准离子电流I0也呈线性增大,同时基准离子电流增大引起幅值ΔI增大.而ΔG/G随着KCl浓度的提高逐渐下降[19],当KCl浓度从0.1 mol/L增加到1.0 mol/L时,ΔG/G减小,ΔI/I0也减小.

不同浓度下过孔时间分布如图5(h)～(j)所示,从图中可看出,当溶液浓度从0.1 mol/L向1.0 mol/L变化时,DNA的过孔时间分布的峰值从0.292 ms增长到了0.597 ms,说明随着溶液浓度的增加,DNA的过孔速度降低.由于DNA分子表面带负电,溶液浓度改变时,吸附在DNA表面上的阳离子数目也会变化,浓度增加时,DNA分子表面吸附的K+增多,有效净电荷减少,驱动电压不变时,驱动力减小,从而过孔速度变慢,过孔时间增加[20].

2.3 不同纳米孔实验结果对比

为了对比MoS2纳米孔和Si3N4纳米孔的性能,实验使用了直径相近的MoS2纳米孔和Si3N4纳米孔进行对比,在800 mV电压下,2个纳米孔的基准离子电流接近.

图6(a)为DNA分子通过2种纳米孔时的时间和幅值分布散点图,可以看出,两者的幅值有较为明显的区分.图6(b)为消除纳米孔尺寸的影响,使用标准幅值比ΔI/I0进行比较.根据ΔI/I0频率分布及峰值拟合图可见,Si3N4纳米孔的ΔI/I0峰值分别为0.003 6和0.007 8,MoS2纳米孔的ΔI/I0峰值约为0.012 2.对比发现,由于MoS2薄膜的超薄特性,使得DNA分子在MoS2纳米孔中的空间占位比更大,所检测的离子电流幅值以及标准幅值比ΔI/I0约为Si3N4纳米孔的3倍,这证明了MoS2纳米孔具有更高的灵敏性.

文献[21]通过α-溶血素纳米通道的空间限域效应研究了DNA(B40)和P53蛋白的弱相互作用,该弱相互作用的原理是根据两者结合后相互作用发生变化，使阻塞离子电流随之相应改变.文献[22]采用不同大小的Si3N4纳米孔进行DNAT8的检测,发现纳米孔尺寸越小,DNA在孔内受限空间越大,所造成的阻塞离子电流比和通过纳米孔的时间均越大.从图6可以看出,DNA通过Si3N4纳米孔的阻塞离子电流和标准幅值比均存在2个峰值,这是由于DNA通过纳米孔的方式不同造成的空间限域不同所引起的,DNA通过Si3N4纳米孔内标准幅值比计算公式为[23]

(a) 过孔时间及幅值散点图

(b) 标准幅值比ΔI/I0对比

(5)

式中,dDNA为DNA的直径;dpore为纳米孔的直径,本实验中,dpore=39 nm.根据DNA通过Si3N4纳米孔的标准幅值比ΔI/I0,计算出峰值0.003 6对应的DNA直径为d1=2.34 nm,峰值0.007 8对应的DNA直径为d2=3.43 nm,而双链DNA直径为2.2 nm,因此可以推断DNA在Si3N4纳米孔中分别以非折叠和折叠2种形式过孔.

通过对比DNA两种纳米孔的过孔时间可以发现,虽然MoS2薄膜的厚度比氮化硅纳米孔的厚度小,相同电压下施加在纳米孔上的电势要高,但同时DNA分子驻留在纳米孔中的片段所带的电荷量也较小[10],因此电泳驱动力相同,导致过孔速度变化不大.

3 结论

1) 通过机械剥离、转移的方法获得单少层MoS2，并用聚焦离子束制备了MoS2纳米孔.

2) 随着电压的升高,λ-DNA通过MoS2纳米孔时所产生的阻塞电流信号幅值和标准幅值比都随着电压的升高而升高,过孔时间随着电压的升高而减小.

3) 随着KCl溶液浓度的降低,λ-DNA通过MoS2纳米孔时产生的阻塞电流信号幅值随之下降,标准幅值比却随之升高,同时过孔时间减少.

4)λ-DNA通过MoS2纳米孔所产生的阻塞离子电流幅值明显高于通过Si3N4纳米孔的阻塞离子电流,归一化后的标准幅值比提升约3倍,证明二硫化钼薄膜具有更高的灵敏性和信噪比.

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