mPTP在心肌线粒体氧化应激损伤诱导细胞凋亡的研究进展

韩学超+徐森+徐菁蔓

【摘要】 自1970年线粒体膜转换特性被发现至今，线粒体在调控细胞凋亡，控制物质进出方面的作用已经获得广泛认可。线粒体通透性转化孔（mPTP）是该特性的载体，当内膜通透性增加时，一些分子量小于1.5×103 Da的小分子可以自由通过。现有研究表明，氧化应激，钙超载，活性氧（ROS）增加等参与了心肌缺血再灌注损伤，但是氧化应激通过线粒体途径诱导心肌细胞凋亡的具体机制，及mPTP的具体分子结构、功能和调控节点尚不清楚。因此本文中主要对现在公认的线粒体mPTP的结构以及氧化应激状态下心肌细胞模型线粒体mPTP的各种病理变化以及可能涉及的损伤机制的研究进展进行综述，论证mPTP的靶向治疗对抑制心肌细胞凋亡的可行性，为治疗心肌缺血再灌注损伤提供一些新的研究思路。

【关键词】 线粒体； mPTP； 氧化应激； 心肌细胞； 凋亡

【Abstract】 Since 1970，mitochondrial membrane transition properties have been found so far，mitochondria in the regulation of apoptosis，control of substances in and out of the role has been widely recognized.Mitochondrial permeability conversion pore（mPTP） is the carrier of this characteristic.When the permeability of the membrane increases， some small molecules with molecular weight less than 1.5×103 Da are free to pass.Previous studies have shown that oxidative stress， calcium overload， and reactive oxygen species（ROS） are involved in myocardial ischemia-reperfusion injury，but the specific mechanism of oxidative stress through mitochondrial pathway-induced cardiomyocytes apoptosis and the specific molecular structure of mPTP，function and control node is not clear.Therefore，this article mainly on the now recognized mitochondrial mPTP structure and oxidative stress cardiomyocytes model mitochondrial mPTP various pathological changes and possible damage mechanisms involved in the research progress，demonstrated mPTP targeted therapy to inhibit cardiomyocytes.The feasibility of apoptosis for the treatment of myocardial ischemia and reperfusion injury provide some new research ideas.

【Key words】 Mitochondria； mPTP； Oxidative stress； Cardiomyocytes； Apoptosis

First-authors address：North China University of Science and Technology，Tangshan 063210，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.02.032

心臟中心肌细胞经过短暂的缺血缺氧后，给予缺血缺氧的心肌细胞快速恢复血供时，虽然能使心肌细胞的血液供应恢复到以前的状态，但是对心肌细胞的损伤不仅没有得到相应的缓解，反而使心肌细胞的损伤程度加深加重，严重时甚至可能出现心肌细胞的凋亡，称其为心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI）[1]。

细胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）是定义为在相关联的基因、蛋白、信号通路的控制之下，机体通过“自杀性”的方式清除本身体内非必需的细胞，以及特定的或者有一定程度损伤的细胞的过程[2]。PCD的分类：内源性凋亡与外源性凋亡，细胞自噬，坏死性凋亡等[3]。

氧化应激反应是氧化自由基的生成功能和抗氧化功能之间的失衡，使生成的氧化自由基逐渐发生脂质过氧化反应形成脂质过氧化物丙二醛（MDA），进而造成心肌细胞的损伤，引发心肌细胞内肌浆网内的Ca2+摄取减少，使得胞内Ca2+含量极速上升引发Ca2+超载，线粒体基质过度肿胀，可以进一步激活与凋亡相关的蛋白，如细胞色素C（Cyt C）释放和caspase相关蛋白的激活，发生不可逆的损伤甚至使心肌细胞发生凋亡[4]。因此线粒体损伤诱导的细胞凋亡是心肌细胞氧化应激损伤的重要机制之一。

1 线粒体简介

心肌细胞内的大量线粒体是细胞的“能量工厂”，是细胞内的重要能源物质腺嘌呤核苷三磷酸的生成场所，线粒体还可以维持Cl-、Ca2+等离子的相对平衡，进而调节凋亡和坏死，许多生化反应例如三羧酸循环、电子传递以及氧化磷酸化等也都在线粒体中进行。已有研究表明了线粒体参与了氧化应激以及细胞凋亡等多种生命活动，对心肌细胞功能的正常行使具有非常重要的意义[5]。心肌细胞中有着所有细胞中数量最多的线粒体，占心肌细胞总体积的40%～60%，故而线粒体的形态只要发生轻微的改变，就会影响其功能的正常行使，导致心肌细胞的凋亡甚至心脏功能的巨大改变。endprint

2 mPTP结构

现有研究发现，线粒体膜的通透性与其结构功能关系密切，与MIRI也有着密不可分的联系。线粒体通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）是线粒体内膜与外膜之间的非特异性高导电性的通道，主要通过控制心肌细胞的氧化磷酸化来调控能量代谢，调节线粒体膜的通透性，维持内外离子的相对恒定，对形成稳定的电势差和维持膜电位的稳定有重要作用[6]。

mPTP为一种多蛋白的复合体结构，但是其具体结果尚不明确，现在学界普遍认为其主要成分为线粒体内膜上的腺苷酸转运蛋白（adenine nucleotide translocator，ANT），线粒体外膜上的电压依赖性阴离子通道（voltage-dependent anion channel，VDAC），线粒体基质中的亲环素D（cyclophilin D，Cyp D）[7]。ANT主要催化细胞质中的ADP与线粒体中ATP转换，为mPTP的非必需成分；VDAC是一种重要的跨膜蛋白，对于控制一些能量代谢物质如ADP与ATP进入线粒体进行相互转化非常重要，还可以促进Bcl-2家族中的一些促凋亡的蛋白与线粒体的外膜相互结合，介导Cyt C的释放进而导致线粒体依赖的细胞内源性凋亡[8]；Cyp D是免疫抑制药环孢素（例如环孢素A）在细胞内的一类蛋白结合位点，其活性受Ca2+浓度的调节，细胞内高Ca2+时介导mPTP的开放，对于Cyp D是否是mPTP的重要成分尚存在疑问[9]。

3 mPTP的功能

线粒体mPTP的结构和功能直接影响着心肌细胞的功能，心肌细胞线粒体上的mPTP的病理性开放是MIRI中不可避免关键因素，线粒体基质肿胀和线粒体mPTP长时间开放可以导致线粒体呼吸传递链抑制，膜电位下降，膜间正离子集聚等系列病理性变化。

mPTP有三种开闭状态：线粒体的跨膜电位完整时的完全关闭的状态；可以传导电信号和钙信号的较低水平的可逆性的开放状态；导致心肌细胞的不可逆变化甚至凋亡的高水平的不可逆开放状态[10]。

4 mPTP在凋亡中的作用

mPTP引起凋亡的大体机制如下：三羧酸循环终止，引起外膜破碎，释放Cyt C，活化caspase系列蛋白，通过caspase依赖机制使心肌细胞走向凋亡[11]。氧化应激、线粒体内Ca2+超载、线粒体内膜电位降低、ROS大量生成，无机磷酸盐、NO等物质都会导致线粒体mPTP的病理性开放。现有研究表明氧化应激反应是MIRI中引起心肌细胞损伤非常重要的因素之一，可以使线粒体mPTP上的结构蛋白发生构象改变，进而导致线粒体通透性异常，mPTP病理性开放，激发下游通路，导致不可逆损伤，最终引发心肌细胞凋亡[12]。

线粒体mPTP因外界或病理条件大量开放时，细胞内乳酸脱氢酶（LDH）和磷酸肌酸激酶（CPK）活性明显升高，超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性显著下降，ROS与MDA大量生成，线粒体内的Cl-浓度升高，胞内Ca2+超载明显，引起线粒体膜电位崩溃，氧化磷酸化脱耦联，ATP生成障碍。而一些凋亡因子例如Cyt C释放后，激活caspase相关的凋亡蛋白。

Cyt C是线粒体呼吸链中复合体Ⅲ、 Ⅳ的重要组成部分，为一种细胞核核基因编码的水溶性蛋白质，对细胞的能量代谢有着十分重要的作用，其位于线粒体内膜的外侧，分子量在12 kDa左右，可以传导和放大凋亡型号，是心肌细胞凋亡的重要调控因子[13]。近年来对Cyt C的研究已经从控制细胞的代谢过程发展到了探讨其对细胞凋亡的影响。在凋亡过程中线粒体不仅丧失氧化产能的功能，更加重要的是由线粒体mPTP调控和释放Cyt C控制的细胞凋亡过程被激活[14]。Cyt C可以在ATP/dATP存在的条件下与蛋白酶活化因子进行结合而形成多聚体结构，进一步活化caspase-9，而caspase-9作为凋亡的启动者，释放之后收到信号便开始通过自剪和接合的方式激活，但是caspase-9并不能降解细胞本身的蛋白质，而是通过caspase级联反应来进一步活化下游不具有自我激活的能力的casepase-3，引起一系列连锁反应[15]。caspase-3活化之后作为凋亡的执行者，直接作用于损伤的心肌细胞，破坏细胞内多种重要结构和功能蛋白，使其进一步降解为凋亡小体，引起心肌细胞凋亡[16]。因此将线粒体mPTP的开放程度降低或抑制mPTP的病理性开放可以有效地保护心肌细胞，避免心肌细胞的凋亡，进一步保护心脏功能的正常行使。

5 线粒体mPTP调控作用的两种可能机制

5.1 VDAC假说 有些研究认为VDAC是一种位于细胞线粒体外膜保守的孔道蛋白，可以在线粒体膜上形成亲水性的电压依赖通道，是线粒体与细胞质之间的主要物质交换通道，将内膜和外膜一分为二，是调控心肌细胞凋亡的重要节点[17]。VDAC对线粒体内外的物质运输有着重要的作用，VDAC蛋白结构的动态变化是VDAC关闭和开放的重要原因，因此在mPTP的开闭中也承担着重要角色。其中VDAC就控制着Cl-的跨线粒体膜的运输，Cl-是细胞中具有非常重要的生理意义的阴离子，其浓度的异常变化会影响细胞的内环境的pH，而pH又可以影响到膜信号的转导、Ca2+的稳态、兴奋—收缩耦联机制、生长代谢等一系列生理过程[18]。通过削弱“氯增加诱发钙小体释放机制”的触发作用，可以有效地减轻氧化应激反应，钙超载，维持线粒体膜电位的相对稳定，抑制Cyt C的病理性释放和caspase系列凋亡蛋白的激活，最后减少心肌细胞的凋亡[19]。文献[20]显示，4，4-二异硫氰基芪-2，2-二磺酸（4，4-diisothiocyanostilbene-2，2-disulfonicacid，DIDS）可以取消线粒体膜电位的震荡，也可以特异性的阻断VDAC，关闭线粒体mPTP。当除去细胞外的Cl-或者是加入Cl-阻断剂DIDS后可以减轻心肌细胞的损伤程度并减少心肌细胞的凋亡，VDAC还可以通过闭合mPTP来阻断ADP进入线粒体内，间接阻断ATP的合成和流动，因此还可以影响细胞能量的产生[21]。线粒体通透性的改变需要内膜和外膜的同时改变，外膜上的某些特定区域可以作為它们相互作用的接触位点，可以与胞内多种蛋白结合，而VDAC就是细胞质与外膜进行结合的位点。VDAC1是VDAC的三种亚型之一，控制物质运输，与Bcl-2家族蛋白互相作用之后可以改变线粒体外膜的通透性，导致Cyt C的释放及其他相关的凋亡因子进入胞浆，引起心肌细胞的凋亡[22]。用RNAi特异性的沉默VDAC1之后，心肌细胞的氧化应激反应减弱，钙离子超载程度减轻，保护了线粒体的膜电位，线粒体mPTP的开放程度有一定的削弱，线粒体中Cyt C的释放被抑制及活化的caspase-9，caspase-3等系列凋亡蛋白含量显著减少[23]。正常的情况下Cyt C是无法通过线粒体外膜的，Cyt C的释放受到VDAC与Bcl-2之间反应的影响，一些位于细胞内的促凋亡因子如Bax以及Bak等与VDAC结合后，增强了VDAC的活跃程度，促进了线粒体mPTP的开放。VDAC的高表达使其由单体形式向低聚体的形式转变，形成了巨大的孔道，这使得内膜区的凋亡因子得以释放，如Cyt C释放[24]。VDAC的高表达还增加了ROS的生成量，加重了氧化应激反应程度，使细胞的凋亡程度加重。而一些抗凋亡因子例如Bcl-2以及Bcl-xl位于线粒体的外膜上，可以和VDAC直接接触并结合发生反应而使得VDAC得以关闭，进而抑制Cyt C的释放[25]。endprint

5.2 Cyp D假说 最近有些研究认为Cyp D是mPTP结构的重要亚基，而VDAC与ANT可能不是线粒体mPTP的必需亚基[26]。当把由Ppif基因编码的基质的Cyp D的Ppif基因敲除，发现其能有效地减少心肌细胞的Ca2+超载和氧化应激损伤，一定程度上增强心肌细胞的抗凋亡能力[27]。自从2013年来一些学者发现新的线粒体mPTP结构模型，丰富了mPTP的研究后，某些学者认为内膜上的ATP合成酶C亚基参与了线粒体mPTP的形成，能与Cyp D结合并形成相应的复合物来调节mPTP的开放[28]。ATP合成酶是ADP合成ATP必不可少的酶类，是线粒体作为能量工厂的重要支撑，这也进一步说明了mPTP不仅是细胞凋亡中的重要调控节点，也是线粒体产能的重要通道。而环孢素A（CsA）可以通过与Cyp D的结合来抑制线粒体mPTP的病理性开放，进而防止线粒体内膜去极化以及caspase相关蛋白的活化，发挥抑制凋亡作用。最终起到减轻氧化应激损伤，改善细胞线粒体的功能的作用。

心肌细胞在发生氧化应激损伤时，细胞内离子浓度非正常波动，活性氧以及一些酶类的生成异常，都会导致线粒体mPTP发生病理性的开放，释放Cyt C，激活caspase系列相关蛋白及其凋亡通路等一系列病理变化，导致心肌细胞走向凋亡。虽然线粒体mPTP的主要结构已经被大多数人所接受，但是起到主要调控作用的蛋白组分尚不明确，目前的两种主要的假说：VDAC假说以及Cyp D假说都存在一定的疑问和不足，线粒体mPTP的准确结构尚不清楚，因此明确mPTP在心肌细胞氧化应激线粒体损伤诱导细胞凋亡中的准确作用在MIRI的研究以及治疗中至关重要。

参考文献

[1] Iniguez M，Doctor J，Feijoo E，et al.Novel pharmacologic strategies to protect the liver from ischemia-reperfusion injury[J].Recent Pat Cardiovasc Drug Discov，2008，3（1）：9-18.

[2] Nagata S，Tanaka M.Programmed cell death and the immune system[J].Nature Reviews Immunology，2017，17（5）：333.

[3] Vanden B T，Linkermann A，Jouan-Lanhouet S，et al.Regulated necrosis： the expanding network of non-apoptotic cell death pathways[J].Nature Reviews Molecular Cell Biology，2014，15（2）：135-147.

[4] Vassort G，Turan B.Protective role of antioxidants in diabetes-induced cardiac dysfunction[J].Cardiovascular Toxicology，2010，10（2）：73.

[5] Kim B，Takeuchi A，Koga O，et al.Mitochondria Na+-Ca2+ Exchange in Cardiomyocytes and Lymphocytes[J].Advances in Experimental Medicine & Biology，2013，961（3）：193-201.

[6] Grimm S，Brdiczka D.The permeability transition pore in cell death[J].Apoptosis，2007，12（5）：841.

[7] Tsujimoto Y，Nakagawa T，Shimizu S.Mitochondrial membrane permeability transition and cell death[J].Biochimica et Biophysica Acta（BBA）-Bioenergetics，2006，1757（9-10）：1297-1300.

[8] Banerjee J，Ghosh S.Bax increases the pore size of rat brain mitochondrial voltage-dependent anion channel in the presence of tBid[J].Biochemical & Biophysical Research Communications，2004，323（1）：310-314.

[9]冯阳，刘建军，黄钢.线粒体膜通透性转换孔结构与功能研究进展[J].上海交通大学学报（医学版），2012，32（3）：356-360.

[10]任会荣，钱令嘉.線粒体通透性转换孔、细胞色素C与细胞凋亡[J].生命的化学，2002，22（4）：316-318.

[11] Ong S B，Samangouei P，Kalkhoran S B，et al.The mitochondrial permeability transition pore and its role in myocardial ischemia reperfusion injury[J].Journal of Molecular & Cellular Cardiology，2015，78：23-34.

[12] Ji L，Fu F，Zhang L，et al.Insulin attenuates myocardial ischemia reper fusion injury via reducing oxidative/nitrative stress[J].Am J Physiol Endocrinol Metab，2010，298（4）：871-880.endprint

[13] Sheridan C，Martin S J.Mitochondrial fission/fusion dynamics and apoptosis[J].Mitochondrion，2010，10（6）：640.

[14] Zamaraev A V，Kopeina G S，Prokhorova E A，et al.Post-translational Modification of Caspases：The Other Side of Apoptosis Regulation[J].Trends in Cell Biology， 2017.

[15] Halestrap A P，Richardson A P.The mitochondrial permeability transition：A current perspective on its identity and role in ischemia/reperfusion injury[J].Journal of Molecular & Cellular Cardiology，2014，78：129-141.

[16] Shoshanbarmatz V，Benhail D.VDAC，a multi-functional mitochondrial protein as a pharmacological target[J].Mitochondrion，2012，12（1）：24-34.

[17] Duan D.Phenomics of cardiac chloride channels：the systematic study of chloride channel function in the heart[J].Journal of Physiology，2009，587（10）：2163-2177.

[18] Lai Z F.The relationship between intracellular chloride concentration and ischemia reperfusion-induced arrhythmias in myocardial cells[J].Zhongguo Yi Xue Ke Xue Yuan Xue Bao Acta Academiae Medicinae Sinicae，2002，24（2）：190.

[19] Parkerson K A，Sontheimer H.Biophysical and Pharmacological Characterization of Hypotonically Activated Chloride Currents in Cortical Astrocytes[J].Glia，2004，46（4）：419-436.

[20] Ujwal R，Cascio D，Colletier J P，et al.The crystal structure of mouse VDAC1 at 2.3 A resolution reveals mechanistic insights into metabolite gating[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2008，105（46）：17742-17747.

[21] Li H，Zheng L，Mo Y，et al.Voltage-Dependent Anion Channel 1（VDAC1） Participates the Apoptosis of the Mitochondrial Dysfunction in Desminopathy[J].PLoS One，2016，11（12）：e0167908.

[22] Liu Z，Luo Q，Guo C.Bim and VDAC1 are hierarchically essential for mitochondrial ATF2 mediated cell death[J].Cancer Cell International，2015，15（1）：34.

[23] Keinan N，Tyomkin D，Shoshan-Barmatz V.Oligomerization of the mitochondrial protein voltage-dependent anion channel is coupled to the induction of apoptosis[J].Molecular & Cellular Biology，2010，30（24）：5698.

[24] Zhou F，Yang Y，Xing D.Bcl-2 and Bcl-xL play important roles in the crosstalk between autophagy and apoptosis[J].Febs Journal，2011，278（3）：403-413.

[25] Soriano M E，Scorrano L.The interplay between BCL-2 family proteins and mitochondrial morphology in the regulation of apoptosis[J].Advances in Experimental Medicine & Biology，2010，687（687）：97-114.

[26] Giorgio V，Bisetto E，Soriano M E，et al.Cyclophilin D Modulates Mitochondrial F 0 F 1 -ATP Synthase by Interacting with the Lateral Stalk of the Complex[J].Journal of Biological Chemistry，2009，284（49）：33982.

[27] Baines C P，Kaiser R A，Purcell N H，et al.Loss of cyclophilin D reveals a critical role for mitochondrial permeability transition in cell death[J].Nature，2005，434（7033）：658.

[28] Huang K，Lu S J，Zhong J H，et al.Comparative analysis of different cyclosporine A doses on protection after myocardial ischemia/reperfusion injury in rat[J].Asian Pacific Journal of Tropical Medicine，2014，7（2）：144.

（收稿日期：2017-10-20） （本文編辑：程旭然）endprint