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大孔树脂分离纯化沙枣总黄酮的工艺

2018-02-06兰蓉刘卉李浡

江苏农业科学 2017年15期
关键词:分离纯化沙枣总黄酮

兰蓉 刘卉 李浡

摘要:为了确定大孔树脂分离和纯化沙枣总黄酮的工艺条件,以大孔树脂静态吸附量和解吸率为指标,在7种大孔树脂中筛选出分离沙枣总黄酮的最佳大孔树脂型号,采用单因素试验优化这种大孔树脂的吸附、洗脱条件。结果表明,在7种大孔树脂中,XAD7HP型树脂纯化沙枣总黄酮的性能最好,其最佳分离、纯化工艺条件如下:样品质量浓度0.05 mg/mL,上样pH值为4,上样流速为0.5 mL/min,最大上样量为30 mL,洗脱液为60%乙醇,洗脱流速为 0.5 mL/min,最大洗脱体积为40 mL。在所确定的工艺条件下,XAD7HP型大孔树脂能较好地用于沙枣总黄酮的分离纯化,总黄酮的纯度由原来的15.24%提高到了48.77%。

关键词:沙枣;总黄酮;大孔树脂;分离纯化

中图分类号: R284.2文献标志码: A

文章编号:1002-1302(2017)15-0160-04

沙枣(Elaeagnus Angustifolia L.),别称桂香柳、七里香等,为胡颓子科胡颓子属植物,在我国新疆、青海和宁夏等西北省(区)的栽培面积达13万hm2以上[1],是民间治疗呕吐和胃胀的传统药方,多用于脾胃虚弱、消化不良、肠炎腹泻、肺热咳嗽等疾病的治疗[2]。据报道,沙枣果实富含黄酮、鞣质、齐墩果酸等功能性成分和营养成分,具有抗氧化、抗肿瘤、免疫调节、抗炎镇痛、抗腹泻和抗疲劳等多种药物用途和营养价值,是西北地区具有开发利用前景的重要资源[3-9]。

近年来,国内外科研工作者对沙枣中的主要功能性成分——黄酮开展了一些研究工作。比如Si等从沙枣树皮中分离得到了儿茶素、表儿茶酸、没食子儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素、槲皮素和毛地黄黄酮等黄酮类化合物[10]。王基云等研究发现,沙枣花醇提物的总黄酮含量为27 mg/g,能够抑制自由基诱导的肝脏脂质过氧化损伤作用[11]。但是目前仍未有沙枣果黄酮分离纯化的研究报道,所以本试验通过比较7种不同型号的大孔吸附树脂对沙枣果总黄酮吸附性能的差异,探讨分离纯化沙枣果总黄酮的工艺条件,以期为沙枣这一特色资源的开发利用提供试验依据。

1材料与方法

1.1仪器与设备

SHA-C型恒温振荡器(常州国华电器有限公司);玻璃柱(Ф 1 cm×30 cm,上海琪特分析有限公司);BT300-2J/YZⅡ25型恒流泵(保定兰格恒流泵有限公司);SHB-Ⅳ型双循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司);AR2140型电子分析天平(奥豪斯国际贸易有限公司);LABOROTA 4000型旋转蒸发仪(Heidolph);UV-1800PC-DSLL型紫外-可见分光光度计(上海美普达仪器有限公司);PHS-3C型酸度计(上海楚柏仪器有限公司)。

1.2材料与试剂

试验材料:沙枣,购自新疆哈密瓜乡果业股份有限公司。试验试剂:D101型大孔树脂(国药集团化学试剂有限公司);XAD7HP型大孔树脂(美国罗门哈斯公司);NKA-2、X-5、NKA-9型大孔树脂(郑州勤实科技有限公司);HPD100B、AB-8型树脂(河北沧州宝恩化工有限公司);其他试剂均为国产分析纯。

1.3试验方法

1.3.1大孔树脂的预处理大孔树脂用体积分数95%乙醇浸泡24 h充分溶胀后,湿法装柱,再用体积分数95%乙醇淋洗至流出液与水混合液(体积比1 ∶5)不呈白色为止,然后用大量纯净水洗尽乙醇(无醇味),备用。

1.3.2样品制备[12]取粉碎后的沙枣,加入20倍(质量体积比)的85%乙醇常温浸泡24 h后过滤、减压浓缩、60 ℃干燥,制得干燥浸膏样品。精确称取干燥浸膏2 g,加90 mL水超声处理,使其充分溶解后,将溶液定容至100 mL量瓶中,作为备用液。

1.3.3黄酮含量的测定

1.3.3.1黄酮标准曲線的制备称取芸香苷10.0 mg,用60%乙醇完全溶解,在50 mL容量瓶中定容,得到0.2 mg/mL芸香苷对照品溶液。

精确吸取芸香苷对照品0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL分别置于25 mL容量瓶中,补加蒸馏水使所有容量瓶内液体都在相同刻度线,加1 mL 5% NaNO2,室温放置6 min;加1 mL 10% Al(NO3)3,室温放置6 min;加1 mol/L NaOH 10 mL,用60%乙醇定容至25.00 mL,摇匀后放置15 min,在波长 505 nm 处测各溶液的吸光度。以吸光度(ρ)为纵坐标、浓度(C)为横坐标制作工作曲线,结果得到标准方程为ρ=0.086 9C-0000 6,r2=0.999 9。

1.3.3.2样品黄酮含量的测定称取固体样品100 mg,加入 HCl-乙醇(体积比1 ∶25,HCl、乙醇浓度分别为1%、70%)定容到10.0 mL,超声15 min,取2.0 mL上清液,加 1 mL 5% NaNO2,室温放置6 min;加1 mL 10% Al(NO3)3,室温放置 6 min,加1 mol/L NaOH 10 mL,用60%乙醇定容至25.00 mL,在波长505 nm处测吸光度。

1.3.4树脂的筛选

1.3.4.1树脂含水量的测定称取2 g预处理后抽干水分的大孔树脂,置于80 ℃的干燥箱中干燥至恒质量,根据树脂的湿质量和干质量,用公式Y=(1-m1/m0)×100%计算树脂的含水量。其中:Y为树脂的含水量,%;m1为干树脂的质量,g;m0为湿树脂的质量,g。

1.3.4.2各种树脂静态吸附量和解吸率的测定准确称取5 g各种型号湿树脂(用滤纸吸干表面水分),置于100 mL三角锥形瓶中,加入30 mL配制好的沙枣总黄酮水溶液,在 30 ℃ 下以100 r/min的转速在恒温摇床中振荡2 h,过滤后取样品,通过紫外-可见分光光度法测定过滤液浓度,用以下公式可以计算树脂的静态饱和吸附量、吸附率:endprint

式中:P0为样品液中总黄酮的初始浓度,mg/mL;Pa为吸附平衡后溶液中总黄酮的浓度,mg/mL;Va为样品液体积,mL;m为湿树脂质量,g;Y为树脂的含水量,%。

取上述经静态饱和吸附总黄酮后滤出的树脂,用纯净水冲洗10 min后,用滤纸吸干表面水分,置于锥形瓶中,分别精确加入50 mL体积分数95%的乙醇,用摇床持续振荡5 h后,分别测定洗脱液中总黄酮浓度,按下式计算各型号树脂的解吸率:解吸率=[洗脱液浓度×洗脱液体积]/[(P0-Pa)×Va]×100%。

1.3.5大孔树脂分离纯化沙枣总黄酮的工艺优化

1.3.5.1最佳上样浓度的确定精确称取5.0 g抽干水分的优选树脂,各7份,分别加入30 mL不同质量浓度的沙枣黄酮粗提液,在30 ℃下以100 r/min的转速在恒温摇床中振荡2 h,过滤,测定滤液中黄酮含量,计算吸附率。

1.3.5.2最佳上样pH值的确定精确称取5.0 g抽干水分的优选树脂,各5份,分别加入30 mL质量浓度为 0.05 mg/mL,pH值为2、4、6、8、10的沙枣黄酮粗提液,在 30 ℃ 下以100 r/min的转速在恒温摇床中振荡2 h,过滤,测定滤液中黄酮含量,计算吸附率。

1.3.5.3最佳上样流速的确定选用1 cm×30 cm玻璃柱,用优选后的树脂湿法装柱,按径高比1 ∶10装柱。分别取 10 mL 质量浓度0.05 mg/mL、pH值为4的沙枣黄酮粗提液,分别以0.2、0.5、1.0、2.0、3.0 mL/min流速上样,然后用蒸馏水洗脱至流出液接近无色,分别收集流出残余液、水洗液,继而用70%乙醇进行洗脱,收集流出液至无色,测定各个收集液中的黄酮含量,并计算吸附率。

1.3.5.4最佳洗脱液浓度的确定精确称取5.0 g抽干水分的优选树脂,各5份,分别加入30 mL质量浓度为 0.05 mg/mL、pH值为4的沙枣黄酮粗提液,在30 ℃下以 100 r/min 的转速在恒温摇床中振荡2 h,过滤,过滤后收集吸附残液,测定Pa,继续用蒸馏水洗脱至流出液接近无色,收集水洗液,然后分别用50 mL 30%、45%、60%、75%、95%乙醇溶液洗脱吸附饱和树脂,用摇床持续振荡5 h后,分别测定洗脱液中总黄酮浓度,计算解吸率,筛选最佳洗脱液浓度。

1.3.5.5最佳洗脱流速的确定参照“1.3.5.3”节方法制备沙枣黄酮粗提液,以0.5 mL/min流速上样,待吸附完全后,先用纯净水洗去未吸附部分至水洗流出液无色后,再用60%乙醇分别以0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL/min的流速洗脱,收集洗脱液,测定洗脱液中总黄酮含量,计算各条件下的解吸率。

1.3.5.6泄漏曲线制备按“1.3.5.5”节上样、冲洗后,再用60%乙醇以0.5 mL/min流速洗脱、分段收集流出液,每 5 mL 收集1次,测定收集液中黄酮含量,绘制泄漏曲线。

1.3.5.7洗脱曲线制备根据泄漏曲线试验结果,取30 mL质量浓度为0.05 mg/mL、pH值为4的沙枣黄酮粗提液,以 0.5 mL/min 流速通过层析柱,吸附饱和后,先用蒸馏水洗去树脂表面的糖类及杂质,直至流出液为无色后,再用60%乙醇以0.5 mL/min流速洗脱,每5 mL收集1次,测定洗脱液黄酮含量,绘制洗脱曲线。

1.3.5.8工艺验证试验根据上述试验结果,确定沙枣总黄酮最佳纯化工艺条件,按此条件平行做3次试验,分别计算得率和纯度,相关公式:

黄酮得率=洗脱液中总黄酮质量/上样液中总黄酮质量×100%;

黄酮纯度=洗脱液中总黄酮质量/洗脱液中总固形物质量×100%。

2结果与分析

2.1树脂的筛选结果

由表1可知,XAD7HP、X-5型大孔树脂的吸附能力较强,其中XAD7HP型树脂吸附量最大,而且解吸率比X-5高18.06%。经比较,确定选用XAD7HP型大孔樹脂。

2.2大孔树脂分离纯化沙枣总黄酮的工艺优化结果

2.2.1最佳上样浓度的确定由图1可以看出,随着样品质量浓度的增加,树脂吸附率先上升然后下降并趋于平缓,当样品质量浓度为0.05 mg/mL时,树脂吸附率达到最大值 84.86%。黄酮溶液浓度是影响树脂吸附性能的重要因素之一,样品质量浓度增加,则其黏度增大,黄酮向树脂内部传质速度慢,使得有些黄酮没有及时被吸附就流出来;此外,样品浓度增加,竞争性吸附的杂质也在增加,这些杂质的存在减少了有效吸附面积,导致树脂吸附率下降。从图1还可看出,提高样品质量浓度有利于提高树脂的吸附效果,但是样品质量浓度过高的话,反而会降低树脂吸附率,因此用XAD7HP树脂吸附沙枣黄酮时,样品质量浓度以0.05 mg/mL左右为宜。

2.2.2最佳上样pH值的确定从图2可以看出,样品液pH值为4时,XAD7HP树脂的吸附率最高;当pH值>4时,随着pH值升高,XAD7HP树脂的吸附率下降。原因可能是pH值是影响大孔树脂吸附能力的因素之一,一般来说,酸性化合物在酸性介质中的吸附较充分。黄酮类化合物具有酚羟基,显弱酸性,在酸性条件下吸附较好,但是本试验中样品液pH值为2时吸附率不升反降,可能是酸性太强,样品液中的黄酮类化合物转变为佯盐而溶解,因而不易被吸附[13]。所以,本试验选择pH值为4的沙枣黄酮粗提液上样。

2.2.3最佳上样流速的确定表2结果表明,随着上样流速的增大,XAD7HP型大孔树脂的吸附率下降。原因可能是减慢流速能使待分离物质和树脂充分接触,有利于吸附;但是,流速太慢容易造成死吸附且费时,故根据试验结果,选择上样流速为0.5 mL/min。

2.2.4最佳洗脱液浓度的确定由表3可知,随着乙醇体积分数的不断加大,沙枣总黄酮的解吸率先表现为不断上升;但当体积分数≥75%时,解吸率反而有所下降。可能原因是由于乙醇体积分数的升高会增加醇溶性杂质含量,使得沙枣总黄酮在洗脱液中的溶解度减小,从而造成了解吸率的先升后降。因此,本试验选择60%乙醇作为洗脱剂较为适宜。endprint

2.2.5最佳洗脱流速的确定从图3可以看出,随洗脱流速的加快,沙枣总黄酮的解吸率整体呈下降趋势。对于一定量的洗脱剂而言,加快洗脱流速,会使洗脱剂中的溶质分子与大孔树脂的作用时间缩短,溶质分子来不及扩散到树脂的内表面将黄酮彻底洗脱下来,从而使解吸率下降;但流速过慢时,又会导致操作时间过长,降低生产效率。因此本研究选择洗脱流速为0.5 mL/min。

2.2.6泄漏曲线图4结果表明,沙枣总黄酮在第6份流出液处未吸附率(即洗脱液黄酮浓度)明显增大,之后变化趋于平缓,说明树脂柱在第6份流出液处出现泄漏拐点。为最大程度地吸附沙枣总黄酮,同时又节约料液、提高生产效率,设定第6份处为泄漏点,据此确定30 mL作为最大上样量。

[TPLR44.tif]

2.2.7洗脱曲线由图5可以看出,XAD7HP型树脂的洗脱峰窄而尖锐,被解吸的黄酮主要集中在10~30 mL体积范围内。从第8份流出液开始,总黄酮浓度几乎没有变化,说明树脂柱基本被洗脱干净。为了节约洗脱剂,缩短生产周期,确定40 mL作为最大洗脱体积。

[TPLR55.tif;S+2mm]

2.2.8工艺验证结果在最佳工艺条件下,沙枣料液中总黄酮的得率分别为76.42%、78.17%、79.54%,平均得率为 78.04%;总黄酮的纯度由原来的15.24%提高到48.77%。

3结论与讨论

在1 cm×30 cm玻璃柱中,按径高比1 ∶10湿法装柱,考察了7种不同型号大孔树脂对沙枣总黄酮的静态吸附及解吸性能,由于XAD7HP型大孔树脂对沙枣总黄酮有较高吸附量和解吸率,故选用XAD7HP型树脂进一步优化沙枣总黄酮的分离纯化参数。综合各项试验结果可以确定:采用30 mL质量浓度为0.05 mg/mL、pH值为4的沙枣黄酮粗提液以 0.5 mL/min 流速上样,完全吸附后用蒸馏水洗脱至流出液接近无色,继而用40 mL、60%乙醇以0.5 mL/min速度进行洗脱,可达到XAD7HP型树脂对沙枣总黄酮分离纯化的最佳效果,总黄酮的纯度由原来的15.24%提高到了48.77%,试验结果比较理想。笔者所在课题组将在此试验结果的基础上,继续深入研究沙枣中的黄酮类化合物成分,采用先进分离纯化手段,以期得到高纯度的沙枣黄酮单体,并研究其体外抗氧化活性,为更好地开发利用沙枣这种中药提供更多科学依据。

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