夏蜡梅体外植株再生体系的建立

曹艳春+赵振利

摘要：以夏蜡梅幼嫩叶片为材料进行组织培养，研究建立其体外植株再生体系。结果表明，夏蜡梅叶片愈伤组织、芽、根诱导的最适培养基分别为MS+0.9 mg/L NAA+2 mg/L 6-BA、MS+0.9 mg/L NAA+2 mg/L 6-BA、1/2MS+0.3 mg/L NAA，这为夏蜡梅的快速繁殖及工厂化生产奠定基础。

关键词：夏蜡梅；体外植株；培养基；再生；愈伤组织

中图分类号： S685.990.4+3文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）15-0039-02

夏蜡梅（Calycanthus chinensis Cheng et S. Y. Chang）为蜡梅科夏蜡梅属落叶灌木，是国家二级保护植物，其花形奇特、色彩淡雅，观赏价值高，是一种在园林绿地中常用的花灌木。夏蜡梅初开之花有解暑、清热、理气、止咳等功效，花、根可治胃痛，叶含有挥发性的芳香油，因此，夏蜡梅具有广阔的开发利用前景。目前，生产上夏蜡梅主要靠种子繁殖，由于其繁殖率低、育苗周期长，根本满足不了生产和科研需要，而国内外对夏蜡梅的研究主要集中在营养器官解剖、逆境胁迫对幼苗生理生态特性的影响等[1-4]，利用茎段进行组织培养的研究相对较少[5-6]，且存在繁殖系数低、组培系统不完善等问题。本研究利用夏蜡梅幼苗叶片，通过筛选其组织培养的基本培养基、植物生长调节剂种类、水平及使用比例，建立其高效的体外植株再生体系，为其新品种培育、分子生物学研究和工厂化生产奠定基础。

1材料与方法

1.1试验材料

2年生夏蜡梅健康植株，由河南省中牟县白沙镇蜡梅资源圃提供，取其幼嫩叶片作为外植体进行组织培养，建立体外植株再生体系。

1.2试验方法

1.2.1夏蜡梅外植体的预培养将采集的夏蜡梅幼嫩叶片用75%乙醇（酒精）消毒30 s，无菌水清洗3次；用0.1%氯化汞消毒5 min，用无菌水清洗3次；接种于含有植物激素的MS基本培养基（含蔗糖20 g/L、琼脂粉4.6 g/L）上，在温度为 25±2 ℃、光照強度为130 μmol/（m2·s）、光照时间为16 h/d的培养室内培养。组织培养条件下同。

1.2.2夏蜡梅叶片愈伤组织的诱导以MS为基本培养基（蔗糖质量浓度为20 g/L、琼脂粉质量浓度为4.6 g/L、聚乙烯吡咯烷酮质量浓度为1.5 g/L），分别添加浓度梯度为0.1、0.3、0.5、0.7、1.1 mg/L的萘乙酸（NAA）和浓度梯度为2、4、6、8、10 mg/L的6-苄基腺嘌呤（6-6-BA，简称6-BA）；将夏蜡梅预培养的叶片切成约1.0 cm×1.0 cm的小块，接种于培养基上，培养室内进行愈伤组织的诱导，每组合20瓶，每瓶3个外植体；每隔10 d统计1次愈伤组织诱导率，第50天时根据愈伤组织诱导率的大小确定叶片愈伤组织诱导的最适培养基。愈伤组织诱导率=（诱导出愈伤组织的外植体数/接种的外植体数）×100%。

1.2.3夏蜡梅芽的诱导将诱导产生的夏蜡梅愈伤组织，接种到MS添加不同浓度NAA、6-BA的芽诱导培养基上，NAA、6-BA浓度设置与愈伤组织诱导相同，培养室内进行芽的诱导培养，每组合20瓶，每瓶3块；第30天时观察芽的分化情况，以诱导出的芽肉眼可清晰分辨为标准，计算芽的诱导率，确定芽诱导的最适培养基。芽诱导率=（诱导出芽的外植体数/接种的外植体数）×100%。

1.2.4夏蜡梅根的诱导诱导出的芽长到约3 cm高时，从茎基部剪下，转接到添加浓度梯度为0.1、0.3、0.5 mg/L NAA的1/2 MS生根培养基上，培养室内培养，观察生根情况，第20天时统计其生根率，筛选出夏蜡梅根诱导的最适培养基。根诱导率=（生根的幼芽数/接种的幼芽总数）×100%。

1.3数据分析

采用SPSS 19.0软件对试验数据进行分析，采用LSR法进行多重比较。

2结果与分析

2.1不同激素组合对夏蜡梅叶片愈伤组织诱导的影响

由表1可见，不同激素组合培养基对夏蜡梅叶片愈伤组织（图1-A）的诱导差异明显；NAA质量浓度为0.1～1.1 mg/L 时，随6-BA浓度的升高，夏蜡梅叶片愈伤组织的诱导率逐渐减小，其中，NAA质量浓度为0.9～1.1 mg/L时，随6-BA质量浓度的升高，夏蜡梅叶片愈伤组织的褐化情况逐渐加重；培养基为MS+0.9 mg/L NAA+2 mg/L 6-BA时，夏蜡梅叶片愈伤组织的诱导率相对最大，为100.00%，该培养基作为夏蜡梅叶片愈伤组织诱导的最适培养基。

2.2不同激素组合对夏蜡梅芽诱导的影响

由表1可见，NAA质量浓度为0.5～1.1 mg/L时，随 6-BA 质量浓度的升高，叶片芽诱导率逐渐减小，其中，培养基组合为MS+0.9 mg/L NAA+2 mg/L 6-BA时芽的诱导率相对最大，为59.67%，说明夏蜡梅愈伤组织芽诱导（图1-B）的最适培养基为MS+0.9 mg/L NAA+2 mg/L 6-BA。

2.3不同激素浓度对夏蜡梅根诱导的影响

由表2可见，夏蜡梅芽在没有添加NAA的1/2MS培养基上也可诱导出根（图1-C），生根率为100.00%，但诱导出根的条数相对较少，为3条；培养基1/2MS+0.3 mg/L NAA诱导出根的条数相对最多、根长相对相对最长，分别为6条、3.0 cm，并可形成完整植株（图1-D），可作为夏蜡梅生根的最适培养基。

3结论与讨论

植物体外植株再生与植物品种、基因型和培养条件密切相关。一般情况下，植物基因型在分类学中的亲缘关系越远，体外植株再生体系所需植物生长调节物质的种类和浓度差异就越大[7-9]。前人用夏蜡梅茎段培养时发现，茎段在培养过程中周围培养基有变绿现象，可能为叶绿体的渗透，同时随培养时间的增长，茎段上皮孔增大，有粉末状物质溢出，影响芽的增殖和分化[5]。本研究以夏蜡梅幼嫩叶片为材料，在基本培养基中添加植物生长调节物质，筛选出愈伤组织、芽、根诱导的适宜培养基组合分别为MS+0.9 mg/L NAA+2 mg/L 6-BA、MS+0.9 mg/L NAA+2 mg/L 6-BA、1/2MS+0.3 mg/L NAA。研究中发现，当NAA质量浓度一致时，随 6-BA 质量浓度的升高，夏蜡梅愈伤组织的诱导率呈下降趋势，这与张变莉等结论[10-11]吻合；加入NAA对根诱导有一定的促进作用，能够增加根的数量，提高根的质量。

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