HPV E6/E7 mRNA检测在宫颈病变中应用价值的探讨

贺仁娟，赵 敏*

（1.山西医科大学，山西 太原 030001；2.山西省妇幼保健院，山西 太原 030013）

宫颈癌是世界上第三常见的妇科恶性肿瘤[1]，其发生主要与高危型人乳头瘤病毒（human paplilloma virus，HPV）持续感染密切相关。然而大部分高危型HPV感染多于首次发现后的6到12个月自然回归阴性，多为一过性感染[2]。近些年来各种HPV 检测方法层出不穷，广泛用于宫颈癌的筛查中，但是HPV DNA检测只能反映病毒存在，有研究指出HPV E6/E7 mRNA检测还可以反映病毒基因的活性[3]，用于宫颈癌筛查的有效方法之一。本研究对高危型HPV感染患者行HPV E6/E7mRNA检测，分析HPV E6/E7mRNA与宫颈病变的关系，探究其对宫颈癌筛查的应用价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象

收集2016年11月至2017年11月就诊于山西省妇幼保健院的高危型HPV感染妇女为104例，年龄28～66岁。入组标准：有正常性生活；就诊的前3天内未接受过阴道冲洗、上药等局部处理；3个月内未使用过性激素。排除标准：除外免疫疾患、内外科疾病；除外合并其他阴道炎症。

1.2 分组

在知情同意的前提下，取所有患者宫颈脱落细胞行HPV E6/E7mRNA检测及阴道镜宫颈活检。组织学病理诊断结果判读分为慢性宫颈炎（宫颈炎组）、低度鳞状上皮内病变（low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL）（低级别组）以及高度鳞状上皮内病变（high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL）（高级别组）。随机选取30例患者同时对其宫颈脱落细胞及宫颈石蜡包埋组织标本进行HPV E6/E7mRNA检测，编号分组，分为宫颈脱落细胞组和宫颈石蜡组织组。

1.3 方法

1.3.1 高危型HPV感染的检测

暴露宫颈后，将宫颈刷于宫颈口慢慢搓动，顺时针方向旋转5周。拿出宫颈刷，放入取样瓶内，待检测。用HC-2法测宫颈脱落细胞的13种高危型HPV DNA；试剂盒于美国DIGENE公司购买，按说明书中的步骤进行检测。

1.3.2 HPV E6/E7 mRNA检测

针对14种高危型HPV E6/E7 mRNA，选用河南中美合资科蒂亚生物技术有限公司试剂，用核酸探针信号放大检测技术即支链DNA技术，将样本用特定裂解液裂解，然后经探针杂交与信号放大，即得到基因定量结果。①宫颈脱落细胞检测：将宫颈刷于宫颈口轻轻搓动，顺时针方向旋转5周，取出宫颈刷，折断刷柄，放入取样瓶内待用；②宫颈石蜡包埋组织：所选患者阴道镜检查术后，石蜡包埋宫颈小块组织活检标本，子宫颈石蜡标本均40 μm厚连续切片，将切下的组织装进1.5 mL离心管内，操作时对以上标本对应编号，严格按照试剂盒说明步骤进行操作。

1.3.3 病理性检查

入组患者均行阴道镜活检，以病理诊断确诊，分组。

1.4 统计学处理

采取SPSS 23.0统计学软件对数据进行分析处理，计数资料以百分数（%）表示，采用x2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 研究对象一般情况

入选患者年龄在28～66岁（P=0.078）；孕次和流产次分别在0～5次和0～4次（P=0.174和P=0.820）；初孕年龄和初次性生活年龄在18～30岁和17～27岁（P=0.862和P=0.617）；组间差异均无统计学意义。

2.2 HPV E6/E7 mRNA检测与病理结果比较

HPV E6/E7 mRNA检测在以下各组的阳性率不全相等，差异有统计学意义（x2=11.636，P＜0.05）。再进行x2分割，以α'= 0.0125为界值，结果发现宫颈炎组、低级别组分别和高级别组比较，阳性率差异具有统计学意义（x2分割=9.32、8.98，P＜0.0125），宫颈炎组与低级别组差异无统计学意义（P＞0.0125）。随着宫颈病变级别的升高，HPV E6/E7 mRNA阳性率增加，高级别组阳性率最高。见表1。

表1 HPV E6/E7 mRNA检测与病理结果比较

2.3 两种标本行HPV E6/E7 mRNA检测结果比较

宫颈脱落细胞组HPV E6/E7 mRNA检测（+）20例，检出率为66.67%；宫颈石蜡包埋组织组HPV E6/E7 mRNA检测（+）16例，检出率为53.33%。宫颈脱落细胞、宫颈石蜡包埋组织两种标本测定HPV E6/E7 mRNA结果比较，差异无统计学意义（x2=1.11，P=0.430）。见表2。

表2 两种标本的HPV E6/E7 mRNA检测结果

3 讨 论

宫颈癌的发生主要与HPV的感染密切相关，是最常见的妇科恶性肿瘤之一。研究表明HPV感染非常普遍，超过90%的女性将在一生中经历HPV感染，其中大部分为短暂性感染，90%的感染者两年内会自发消除，不会造成任何宫颈病变[4]，只有极少数患者，在持续 HPV的感染下才进展为宫颈上皮内瘤变和宫颈癌。

人乳头瘤病毒（HPV）是一种小型环状的双链DNA，持续HPV感染后，其会与宿主细胞发生整合，HPV病毒的两条癌基因片段E6、E7转录、翻译出E6、E7蛋白，E6蛋白与肿瘤抑制基因P53结合，促进P53退化，导致其功能障碍；E7蛋白与视网膜母细胞瘤蛋白质（Rb）结合，使Rb蛋白水解，刺激细胞周期失控，从而细胞进入无限繁殖的状态，导致宫颈癌的发生[5]。HPVE6/E7癌基因可以诱导恶性转化，检测HPV E6/E7 mRNA更能反映癌基因的活性，因此我们可以利用HPV E6/E7 mRNA检测来评估HPV阳性患者发展为宫颈癌的风险，识别暂时性感染，避免过度治疗。

本实验结果显示，在3个组中高危HPV E6/E7 mRNA阳性率不全相等，宫颈炎组、低级别组分别与高级别组比较，阳性率差异均有统计学意义，宫颈炎组与低级别组差异无统计学意义。随着宫颈病变级别的升高，HPV E6/E7 mRNA阳性率增加，高级别组阳性率最高。这一结果显示：E6、E7癌基因可能促进宫颈病变的进展，与宫颈病变的严重程度关系密切。这与Castle等[6]的研究结果一致。

本研究收集同一患者的宫颈脱落细胞和阴道镜活检石蜡组织30例行HPV E6/E7 mRNA检测，宫颈脱落细胞标本HPV E6/E7 mRNA检出率为 66.7%，石蜡组织标本HPV E6/E7 mRNA检出率为 56.7%。宫颈脱落细胞、宫颈石蜡包埋组织两种标本测定HPV E6/E7 mRNA结果比较，差异无统计学意义。因此在进行宫颈癌筛查中，两种标本都可以用来进行HPV E6/E7 mRNA检测，宫颈脱落细胞可以无创取材，具有更好的操作性。

本研究中存在以下问题：3例石蜡标本结果阳性，而细胞学检测阴性，可能与宫颈病变位于深层，或者宫颈表面病变细胞坏死有关。6例宫颈脱落细胞检测阳性的患者，石蜡组织结果提示阴性，宫颈涂片采样面积大，而宫颈活检标本只是在特定的点取样以及石蜡标本取材等原因均可以导致这一结果，确切的机制有待进一步研究。

综上所述，HPV E6/E7 mRNA与宫颈癌前病变、宫颈癌之间的关系密切，其作为新一代宫颈癌筛查方法，目前仍有许多新的内容有待探索，需要进一步大样本研究，以便更多的宫颈早期病变被及时发现。

[1] Park S, Eom K, Kim J, et al. MiR-9, miR-21, and miR-155 as potential biomarkers for HPV positive and negative cervical cancer[J]. BMC cancer, 2017, 17(1): 658.

[2] Cattani P, Siddu A, D'Onghia S, et al. RNA (E6 and E7) assays versus DNA (E6 and E7) assays for risk evaluation for women infected with human papillomavirus[J]. Journal of clinical microbiology, 2009, 47(7): 2136-2141.

[3] Fontecha N, Basaras M, Hernáez S, et al. Assessment of human papillomavirus E6/E7 oncogene expression as cervical disease biomarker[J]. BMC cancer, 2016, 16(1): 852.

[4] De Sanjosé S, Diaz M, Castellsagué X, et al. Worldwide prevalence and genotype distribution of cervical human papillomavirus DNA in women with normal cytology: a meta-analysis[J]. The Lancet infectious diseases, 2007, 7(7): 453-459.

[5] Zhang W, Che Q, Tan H, et al. Marine Streptomyces sp. derived antimycin analogues suppress HeLa cells via depletion HPV E6/E7 mediated by ROS-dependent ubiquitin–proteasome system[J].Scientific Reports, 2017, 7: 42180.

[6] Castle P E, Dockter J, Giachetti C, et al. A cross-sectional study of a prototype carcinogenic human papillomavirus E6/E7 messenger RNA assay for detection of cervical precancer and cancer[J].Clinical Cancer Research, 2007, 13(9): 2599-2605.