Beclin1、LC3和mTOR在肝癌中的表达及临床意义

于海，刘清华，肖培伦，王健欣，张明，蒋吉英，李进，于丽，于树娜

（潍坊医学院临床医学院a.人体解剖学教研室，b.组织胚胎学教研室，山东潍坊 261053）

肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，病死率极高。据统计调查显示，每年大约有13万人死于肝癌［1］。虽然肝癌的临床治疗已经取得了一定的进展，但发病率和病死率仍然居高不下，因此，肝癌的发生发展、侵袭转移等机制的研究一直备受关注。近年来，有研究发现，自噬活性的异常改变与肿瘤的发生、发展等密切相关［2-6］。本研究应用免疫组织化学SP法，检测Beclin1、LC3和雷帕霉素靶蛋白（mTOR）三种自噬基因在肝癌组织及正常肝组织中的表达，并结合各相关临床病理指标，探讨Beclin1、LC3和mTOR的表达水平在肝癌发生发展中的作用及其相互之间的关系，从而为肝癌诊疗及判断预后找到分子标志物，制定合理、有效的治疗方案，最终提高患者的生存率。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集潍坊医学院附属医院和齐鲁医院2013年12月—2016年12月肝癌手术切除标本56例，标本均经病理切片HE染色证实为肝癌，所有病例术前均未接受任何放化疗、肝动脉栓塞及免疫治疗。按Edmondson-steiner分级标准：I级8例，Ⅱ级14例，Ⅲ级24例，Ⅳ级10例；分别测量切除后的肿瘤直径，其中≤5 cm者24例，＞5 cm者32例。收集肝癌标本中，男性40例，女性16例；年龄34～80岁，平均62岁；乙肝表面抗原（HBSAg）阳性者38例，阴性表达者18例；甲胎蛋白AFP≥400μg·L－1者30例，＜400μg·L－1者26例；有胆管癌栓者11例。同时取癌旁5 cm外正常肝组织标本40例作为对照组。

1.2 试剂与方法

1.2.1 主要试剂 兔抗人Beclin1多克隆抗体、兔抗人LC3多克隆抗体均购自 Abcam公司，兔抗人mTOR多克隆抗体、通用型免疫组化检测试剂盒、柠檬酸盐缓冲液、DAB显色试剂盒均购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.2.2 免疫组织化学法 所有实验标本均经4%甲醛固定，常规脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋，以5μm厚连续切片。免疫组化技术采取SP法，具体操作严格按试剂盒说明书进行。以PBS液代替一抗作为阴性对照。

1.3 结果判定 采用双盲法评估免疫组化染色切片，Beclin1、LC3和mTOR均以细胞膜和（或）细胞质染成淡黄色、棕黄色或棕褐色为阳性表达。三者均采用二级计分法，阳性细胞计数：随机任选5个高倍镜视野（400×），然后根据每张切片的阳性细胞百分率计数，＜5%为0分，5%～＜25%为1分，25%～＜50%为2分，≥50%为3分。着色强度分类：无着色计0分，淡黄色为1分，黄或棕黄色为2分，褐或棕褐色为3分。两者计分相乘≥4分为免疫组化阳性（＋），＜4分计为免疫组化阴性（－）。

1.4 统计学方法 采用SPSS19.0软件进行统计分析。两变量之间的相关性分析采用Spearman等级分析，计数资料采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Beclin1、LC3和mTOR蛋白在肝癌组织和正常肝组织中的表达 Beclin1蛋白在肝癌组织中的阳性表达率为75%（42／56），在正常肝组织中的阳性表达率为25%（10／40），两组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。

LC3蛋白在肝癌组织中的阳性表达率为70%（39／56），在正常肝组织中的阳性表达率为30%（12／40），两组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。

mTOR蛋白在肝癌组织中的阳性表达率为50%（28／56），在正常肝组织中的阳性表达率为28%（11／40），两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1、图1～3。

表1 Beclin1、LC3和mTOR在肝癌及正常肝组织中的表达／例（%）

图1 Beclin1蛋白在肝癌组织和正常肝组织中的表达（×400）

图2 LC3在肝癌组织和正常肝组织中的表达（×400）

图3 mTOR在肝癌组织和正常肝组织中的表达（×400）

2.2 肝癌组织中Beclin1、LC3和mTOR蛋白表达之间的相关性 Spearman等级分析结果显示，在肝癌组织中Beclin1与LC3在肝癌中的表达呈正相关（r＝0.643，P＜0.01），与mTOR表达之间无明显相关性（r＝－0.167，P＞0.05），LC3与mTOR表达呈负相关（r＝－0.386，P＜0.01）。

2.3 肝癌组织中Beclin1、LC3和mTOR蛋白表达与临床病理特征之间的关系 Beclin1、LC3和mTOR的表达均与年龄、性别、肿瘤大小、HBSAg、AFP值等均无显著相关性（P＞0.05），但与病理学分级和有无胆管癌栓有关（P＜0.05）。见表2。

表2 Beclin1、LC3和mTOR在肝癌组织中的表达与临床病理参数的关系／例（%）

3 讨论

肝癌是临床上最常见的恶性消化道肿瘤之一，其发病率和病死率己上升为我国恶性肿瘤的第2位，其严重威胁着人类的健康生活。近年来，临床上对于肝癌的治疗方法有很多，例如：手术切除、介入治疗及放、化疗等，但其治疗效果均欠佳，总体5年生存率不超过5%。分析其原因为：由于其恶性程度高，早期症状不明显，病情进展速度快，大多数患者被发现时，已发生远处侵袭和转移［7］。因此，通过对肝癌发生、发展、侵袭、转移等相关机制的研究，显得尤为迫切。近年来，有研究发现，自噬基因调控机制失调与肿瘤的发生、发展、侵袭、转移等密切相关［2］。

至今为止，Beclin1作为唯一被发现的哺乳动物参与自噬的特异性基因［8］，该基因位于人类染色体17q21上，大约有150 kb，编码一个2 098 bp的转录产物。有研究显示［9］，在前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤中，Beclin1基因存在缺失性的突变。张创杰［10］研究发现，Beclin1在胰腺癌中的表达低于正常胰腺组织。而本实验结果显示，Beclin1蛋白在肝癌组织（75%，42／56）中的阳性表达率高于正常肝组织（25%，10／40），差异有统计学意义（P＜0.01）。分析其Beclin1在肝癌中高表达的原因，可能是由于肝癌生长迅速，肿瘤细胞需要自噬，以适应营养缺乏和低氧的环境。

LC3作为参与自噬发生的关键基因，其表达水平与自噬活性关系密切，是监测自噬的特异性标志物［11］。LC3包括 LC3-Ⅰ和 LC3-Ⅱ，其中 LC3-Ⅱ可通过活化Atg12，结合Atg5，从而参与形成自噬体。有研究表明，LC3的异常表达与许多恶性肿瘤（例如：胃癌、大肠癌、宫颈癌等）的发生、发展及预后关系密切［12］。Huang等［13］报道了 LC3-Ⅱ在脑胶质母细胞瘤组织中表达降低，自噬活性下降。但是本研究结果显示，LC3蛋白在肝癌组织（70%，39／56）中的阳性表达率高于正常肝组织（30%，12／40），差异有统计学意义（P＜0.01）。上述结果说明，LC3的表达及作用在不同类型肿瘤中是各不相同的，其在肿瘤发生、发展过程中的作用及其分子机制还有待进一步研究。

哺乳动物mTOR作为PI3K／AKT信号传导通路下游的效应靶蛋白，在其信号的传导过程中扮演着重要的角色。当mTOR的活性被抑制时，可阻断其下游S6K1信号传导通路，使细胞由G1向S转变所需的相关蛋白缺乏，细胞周期阻滞于G1期，进而达到影响细胞周期的进展，调节细胞凋亡的作用。张利等［14］研究发现，mTOR在结肠癌组织中的阳性表达率为78.5%，而在正常结肠组织中的阳性表达率为12%，差异有统计学意义（P＜0.05）。本研究结果显示，mTOR蛋白在肝癌组织（50%，28／56）中的阳性表达率也高于正常肝组织（28%，11／40），两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。这说明mTOR的过度表达与激活可能与肝癌的发生、发展关系密切。

经Spearman相关系数检验结果显示，在肝癌组织中Beclin1与LC3在肝癌中表达呈正相关（r＝0.643，P＜0.01），与mTOR表达之间无明显相关性（r＝－0.167，P＞0.05），LC3与 mTOR表达呈负相关（r＝－0.386，P＜0.01）。这说明，三者在肝癌发生发展中的关系密切，Beclin1的高表达可以增强肝癌自噬活性，mTOR的高表达则会抑制肝癌自噬发生，两者可能是通过不同PI3K（包括：Ⅰ型和Ⅲ型）信号传导通路，分别发挥其自噬调控作用：（1）Ⅲ型PI3K复合物Vps15激酶通过调节PI3K的活性后，Beclin1即可将各种Apg蛋白整合到PI3K中，形成复合体来促进自噬的发生；（2）而mTOR接受其上游的Ⅰ型PI3K／AKT信号传到通路调控后，可随后磷酸化它的两个下游分子，即翻译抑制分子eIF-4E结合蛋白 1（4E-BP1）和核糖体蛋白 S6激酶 1（S6K1）［15］，进而来调节肿瘤细胞的生长、增殖，抑制自噬活性。本实验组56例肝癌组织中，Beclin1蛋白阳性表达者为42例，mTOR蛋白阳性表达者为28例，由此可见，Beclin1蛋白阳性表达者高于mTOR蛋白阳性表达者，所以我们推测Beclin1高表达所产生的促进自噬作用明显强于mTOR过表达产生的抑制自噬作用，因此，自噬活性标志分子LC3蛋白表达水平均升高，即肝癌的自噬活性亦随之增高。同时，本实验还证实，在肝癌组织中，Beclin1、LC3和mTOR的表达均与年龄、性别、肿瘤大小、HBSAg、AFP值等均无显著相关性（P＞0.05），但与病理学分级和有无胆管癌栓有关（P＜0.05）。

总之，Beclin1、LC3和mTOR蛋白在肝癌自噬活性调控中，发挥着至关重要的作用，因此联合检测三者的蛋白表达水平，可以更加客观的评估肝癌患者的预后，从而为肝癌诊疗及判断预后找到分子标志物，制定合理、有效的治疗方案，最终提高患者的生存率。

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