miRNA-223-3p在不明原因复发性流产患者绒毛组织中表达以及在血管生成中的作用

高玉霞，董学彩，王文翔，盛修贵

（1.新乡市中心医院妇科，河南 新乡 453000；2.山东省肿瘤医院妇科，山东济南 250100）

不明原因复发性流产是指在排除染色体、解剖、感染、免疫、内分泌等因素后，育龄期妇女与同一性伴侣连续发生自然流产超过2次，约占复发性流产的40%～80%［1］，该病发生机制较为复杂，涉及多因素、多步骤，目前尚未研究清楚。研究表明［2］，绒毛血管增生、滋养细胞增殖、侵袭对正常妊娠至关重要，妊娠早期胚胎发育在相对乏氧环境中进行，乏氧可对滋养细胞侵袭及绒毛血管生成进行调节。因此，乏氧可能在不明原因复发性流产中发挥重要作用。微小RNA（miRNA）作为一种短小单链非编码RNA，在调控细胞增殖、分化、组织和器官发育、血管生成等多种生物学功能中发挥重要作用［3］，miRNA-223-3p作为 miRNA重要类型之一，P70核蛋白体激酶（Rps6kb1）可能是其潜在靶基因或直接作用基因［4］，而Rps6kb1亦是mTOR信号通路下游重要的传递分子［5］，研究表明［6］，mTOR信号通路在调控缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）表达中发挥重要作用。HIF-1α是调控缺氧环境下血管新生中发挥关键性作用［7］。本研究拟对不明原因复发性流产患者绒毛组织中miRNA-223-3p表达进行检测，分析其对Rps6kb1／HIF-1α信号通路的影响，以期为发生不明原因复发性流产发生的可能机制提供线索。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2013年5月—2015年6月在新乡市中心医院不明原因复发性流产患者57例，年龄23～34岁，平均年龄（27.6±4.2）岁，孕龄51～69 d，临床表现阴道出血或腹痛，B超提示无原始心管搏动，临床确诊为难免流产，排除解剖结构异常、染色体异常、感染、免疫、内分泌等原因引起的流产，均连续出现自然流2次及以上，其中，2～3次36例，≥4次21例。同期，选取正常早孕行人工流产术患者42例作为对照组，年龄24～36岁，平均年龄（28.2±4.5）岁，孕龄48～63 d，B超检查及血绒毛膜促性腺激素检查均正常，无先兆流产症状，均排除解剖结构异常、染色体异常、感染、免疫、内分泌等疾病。所有患者行清宫术后留取绒毛组织，每份标本分成2份，1份用生理盐水冲洗后保存于－70℃冰箱中以备检，另1份用甲醛固定后，脱水、包埋、切片，保存于4℃条件下。本研究通过医院伦理委员会批准，所有患者均行知情同意。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂和设备 TRIzol总RNA提取试剂盒由宝生物工程（大连）有限公司提供，逆转录试剂盒和PCR试剂盒均由天根生化科技（北京）有限公司提供，miRNA-223-3p、Rps6kb1、HIF-1α、血管内皮生长因子（VEGF）及内参引物序列均由生工生物工程（上海）股份有限公司设计合成，鼠抗人血管内皮细胞CD34单克隆抗体、HRP标记山羊抗鼠二抗和免疫组化SP法染色试剂盒由北京中杉金桥生物技术有限公司提供，紫外分光光度计购自上海谱元仪器有限公司，实时荧光定量PCR仪购自美国ABI公司。

1.2.2 利用实时荧光定量PCR技术检测绒毛组织中 miRNA-223-3p、Rps6kb1、HIF-1α和 VEGF表达取绒毛组织，研磨后加入细胞裂解液裂解，用TRIzol总RNA提取试剂盒对总mRNA进行提取，并用紫外分光光度计检测纯度，以A260／A280≥1.80作为合格样品。用逆转录试剂盒将总mRNA逆转录为单链模板链cDNA，以cDNA为模板用PCR反应试剂盒进行 PCR，引物序列见表 1。PCR反应条件：94℃ 60 s，94℃ 45 s，56℃ 45 s，74℃ 30 s，连续进行38个循环，以内参为对照，用2－△△Ct法获得绒毛组织中 miRNA-223-3p、Rps6kb1、HIF-1α和 VEGF表达量。

表1 引物序列

1.2.3 免疫组化法检测绒毛组织中微血管密度（MVD） 取绒毛组织切片，脱蜡、水化后，进行抗原修复，加入3%H2O2以使内源性过氧化物没失活。将鼠抗人血管内皮细胞CD34单克隆抗体（1∶500稀释）加入，4℃下过夜孵育，以PBS代替一抗作为阴性对照，将HRP标记山羊抗鼠二抗（1∶800）加入，37℃孵育30 min，PBS冲洗3次，DAB显色30 min，苏木素复染，中性树胶封片，于高倍镜下观察。微血管阳性判定标准：血管内皮细胞或细胞簇出现棕黄色染色，管腔由8个以上红细胞组成，有肌层的不计在内。每个切片均取5个视野进行计数，取均值作为MVD。

1.3 统计学方法 利用SPSS 21.0统计分析软件进行统计学处理。观测资料主要为正态计量资料，采用x±s表示，组间比较采用单因素方差分析或t检验。此外利用Pearson相关分析对变量间相关关系进行分析。P＜0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者绒毛组织中 miRNA-223-3p、Rps6kb1、HIF-1α和VEGF表达比较 不明原因复发性流产患者绒毛组织中miRNA-223-3p表达量高于对照组，而 Rps6kb1 mRNA、HIF-1αmRNA和VEGF mRNA表达量均低于对照组，均差异有统计学意义（t＝17.058、11.947、10.477和 13.383，P＜0.05）；≥4次不明原因复发性流产患者miRNA-223-3p表达量高于2～3次和对照组，而Rps6kb1 mRNA、HIF-1αmRNA和VEGF mRNA表达量低于2～3次和对照组，均差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

2.2 两组患者绒毛组织中MVD比较 免疫组化结果显示，不明原因复发性流产患者绒毛组织中血管发育不良，血管数量减少，管腔变小或消失，见图1。不明原因复发性流产患者绒毛组织中MVD为（23.3±6.1）个，远低于对照组的（41.6±5.3）个，差异有统计学意义（t＝15.476，P＜0.001），≥4次不明原因复发性流产患者绒毛组织中MVD为（18.5±3.7），低于2～3次的（26.8±4.1），差异有统计学意义（t＝7.034，P＜0.001）。

2.3 不明原因复发性流产患者绒毛组织中miRNA-223-3p表达量与HIF-1α和VEGF表达量及MVD相关性 Pearson相关分析显示，不明原因复发性流产患者绒毛组织中miRNA-223-3p表达量与HIF-1αmRNA和VEGF mRNA表达量及MVD均呈负相关（r＝－0.496、－0.638和 －0.597，P＜0.001）；HIF-1αmRNA表达量与VEGF mRNA表达量和MVD均呈正相关（r＝0.584和0.439，P＜0.001）；VEGF mRNA表达量与MVD呈正相关（r＝0.600，P＜0.001）。

3 讨论

复发性流产作为妇产科常见的疾病，发生率约为1%～5%，且随着流产次数增加而再次发生的风险随之增加［8］，目前，大部分复发性流产患者不能找到明确原因，对于这部分患者主要采取注射免疫球蛋白、抗凝血等免疫治疗手段，但仍有20%～30%患者无效［9］，提示不明原因复发性流产患者仍存在其他病因和机制。研究表明［10］，妊娠早期胚胎在相对缺氧的环境中进行，局部氧分压变化可通过调节滋养细胞侵袭能力及绒毛血管生成而影响胚胎发育。HIF-1α作为受氧浓度调节的转录因子，是缺氧环境下诱导血管生成的关键性调控因子［11］，VEGF作为调控血管生成的中枢性物质，可促进血管内皮细胞及滋养细胞增殖而加速血管生成［12］。有研究指出［13］，早孕期宫腔缺氧可诱导滋养细胞表达HIF-1α，HIF-1α可通过促使 VEGF等的表达而促进滋养层细胞增殖及血管生成，以维持胚胎发育所需营养物质供应。本研究显示，不明原因复发性流产患者绒毛组织中HIF-1αmRNA和VEGF mRNA表达量均低于对照组，≥4次不明原因复发性流产患者HIF-1αmRNA和VEGF mRNA表达量低于2～3次和对照组，说明不明原因复发性流产患者早孕期绒毛组织中HIF-1α和VEGF表达量降低，且随着流产次数增多这种抑制作用越强，提示不明原因复发性流产可能与绒毛组织中HIF-1α和VEGF表达下调有关。

表2 两组患者绒毛组织中miRNA-223-3p、Rps6kb1、HIF-1α和VEGF表达比较／x±s

图1 两组患者绒毛组织中MVD（SP法×400）

miRNA-223-3p定位于Xq12，可通过调控其靶基因而调节细胞增殖、凋亡过程，与多种恶性肿瘤发生及侵袭、转移过程有关［14］。研究表明［15］，miRNA-223-3p可作为抑癌基因而发挥作用，可通过调控Artemin、IGF-1R等靶点而抑制实体肿瘤的增殖及侵袭、转移。亦有研究指出［16］，miRNA-223-3p可直接调控IGF-1R下游Akt／mTOR／Rps6kb1信号通路而调控细胞增殖。本研究显示，不明原因复发性流产患者绒毛组织中miRNA-223-3p表达量高于对照组，≥4次不明原因复发性流产患者miRNA-223-3p表达量高于2～3次和对照组，说明miRNA-223-3p在不明原因复发性流产患者绒毛组织中表达上调，且与流产次数有关，提示miRNA-223-3p表达上调可能与不明原因复发性流产有关。本研究显示，不明原因复发性流产患者绒毛组织中Rps6kb1 mRNA表达量均低于对照组，≥4次患者Rps6kb1 mRNA表达量低于2～3次和对照组，说明不明原因复发性流产患者绒毛组织中Rps6kb1信号分子被抑制，Pearson相关分析显示，不明原因复发性流产患者绒毛组织中miRNA-223-3p表达量与HIF-1αmRNA和 VEGF mRNA表达量均呈负相关（r＝－0.496、－0.638，P＜0.001），免疫组化结果亦显示，不明原因复发性流产患者绒毛组织中MVD远低于对照组，提示不明原因复发性流产患者绒毛组织中高表达miRNA-223-3p可能通过抑制Rps6kb1／HIF-1α信号通路而使HIF-1α和VEGF表达降低，使绒毛组织对低氧环境耐受性降低，使血管生成数量减少，导致MVD降低，而使滋养层及胎盘血供不足，使早孕儿血循环障碍而导致流产发生。

综上所述，miRNA-223-3p在不明原因复发性流产患者绒毛组织中表达上调，可能与Rps6kb1／HIF-1α信号通路有关。

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