恶性血液病患者侵袭性念珠菌病中1,3-β-D葡聚糖、甘露聚糖及其抗体联合检测的临床价值

吕晓东，周 玲，郭 珍，宋永平

郑州大学附属肿瘤医院(河南省肿瘤医院)中心实验室 郑州 450008

近年来，新药的使用和支持治疗的进步大大提高了恶性血液病的治疗效果，但由于化疗后伴随长时间的中性粒细胞减少，以及免疫抑制剂和广谱抗生素的使用等因素，侵袭性念珠菌病(invasive candidiasis，IC)的发病率逐年升高，病死率达到19%～49%[1-2]。IC诊断的金标准是血培养，但培养的敏感性低、时间长。1,3-β-D葡聚糖(1,3-β-D glucan, BG)检测现作为常规的IC血清学检测，但其干扰因素较多，特别是恶性血液病患者治疗过程中的中性粒细胞减少以及抗真菌药物的预防性使用等因素，很大程度上影响了G试验的结果。本研究旨在通过G试验联合念珠菌抗原甘露聚糖(mannan, Mn)检测，及其IgG抗体(Mn-IgG)和IgM抗体(Mn-IgM)的检测，评价念珠菌抗原、抗体联合检测在恶性血液病患者IC诊断中的临床价值及其影响因素。

1 对象与方法

1.1研究对象及标本采集2015年10月至2017年2月于河南省肿瘤医院血液科住院的64例患者(男36例，女28例，年龄7～85岁)纳入IC组，入组患者均符合文献[3]诊断标准。根据患者中性粒细胞计数分为5组：中性粒细胞减少Ⅰ级组17例(1.5×109L-1≤中性粒细胞<2.0×109L-1)，中性粒细胞减少Ⅱ级组14例(1.0×109L-1≤中性粒细胞<1.5×109L-1)，中性粒细胞减少Ⅲ级组7例(0.5×109L-1≤中性粒细胞<1.0×109L-1)，中性粒细胞缺乏组7例(中性粒细胞<0.5×109L-1)，非中性粒细胞减少组19例(中性粒细胞≥2.0×109L-1)。根据检测时是否使用抗念珠菌药物分为2组：用药组41例，未用药组23例。取同期健康体检人群作为对照组(共45例，男27例，女18例，年龄27～72岁)。所有入组患者均经本人或委托家属签署知情同意书后晨起空腹采血3 mL，2 000 r/min离心10 min，分离血清，标本保存于-20 ℃，避免反复冻融。初次G试验阳性者，48 h内采血进行第2次G试验复检。

1.2检测试剂和仪器采用天津丹娜生物科技有限公司的BG定量检测试剂盒(动态显色法)、Mn检测试剂盒(ELISA法)、Mn-IgG和Mn-IgM抗体定量检测试剂盒(ELISA法)进行测定。酶标仪型号为SUNRISE，由瑞士Tecan公司生产。操作过程严格按照说明书进行。

1.3检测结果判定标准G试验， >95 ng/L为阳性，<70 ng/L为阴性，70～95 ng/L为灰区；Mn检测，>1.0 μg/L为阳性，<0.5 μg/L为阴性，0.5～1.0 μg/L为灰区；Mn-IgG和Mn-IgM检测，>60 000 AU/L为阳性，<50 000 AU/L为阴性，50 000～60 000 AU/L为灰区。本研究将各项检测灰区结果归为阴性。

1.4统计学处理采用SPSS 20.0进行统计分析。不同组间各指标检测结果的比较采用χ2检验或Fisher确切概率法；应用ROC曲线评价不同抗原、抗体及联合检测在恶性血液病患者IC中的临床检出效果，分别计算并比较其敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值及约登指数。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1念珠菌抗原、抗体单独检测和联合检测结果IC组和对照组念珠菌抗原、抗体检测结果见表1，各项检测指标及其联合检测的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和约登指数见表2，ROC曲线见图1。

表1 IC组和对照组的念珠菌抗原、抗体检测结果 例(%)

*：Fisher确切概率法

表2 念珠菌抗原、抗体单独和联合检测的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值及约登指数

各检测指标的AUC(95%CI)：G试验，0.649(0.573～0.725)；Mn-IgG+Mn-IgM，0.709(0.637～0.781)；Mn，0.768(0.702～0.834)；G试验+Mn+Mn-IgG+Mn-IgM，0.830(0.771～0.888)图1 念珠菌抗原、抗体检测的ROC曲线对比

2.2中性粒细胞减少对念珠菌抗原、抗体检测的影响结果见表3。

表3 中性粒细胞减少和抗真菌药物预防使用对念珠菌抗原及抗体检测的影响 例(%)

*:Fisher确切概率法

2.3抗真菌药物的使用对念珠菌抗原、抗体检测的影响结果见表3。可知，未用药组G试验阳性率高于用药组，差异有统计学意义。

3 讨论

IC是恶性血液病患者接受化疗或造血干细胞移植后常见的并发症。而目前G试验的干扰因素较多，因此需要更加快捷、敏感、特异的检测指标。BG是大部分真菌细胞壁中的一种多糖成分，仅有少数的真菌不含有或表达水平很低[4]。该检测的优势在于它所能检测真菌的范围较广，相对于真菌培养(2 d以上)更能节约时间。它的缺点在于不能区分念珠菌和曲霉菌，且干扰因素较多，例如透析、血液及血制品的输注、细菌感染、β-内酰胺类抗生素和白蛋白的使用等[5]。本研究中，G试验结果与以往文献[6]报道的G试验的敏感性和特异性相近。而对照组中出现的9例G试验阳性，根据后期跟踪随访，推测可能为同期服用β-内酰胺类抗生素或试验污染等因素造成。另外，结果提示48 h内连续2次G试验对于IC的诊断更为准确，但由于2次检测间可能会有临床因素的干扰，如中性粒细胞缺乏、抗真菌药物的使用等，可造成假阴性结果的出现。

Mn是念珠菌细胞壁中另一种具有高度免疫原性的多糖，并且可刺激免疫系统产生IgG和IgM抗体。有研究[7]显示，Mn抗原、抗体单独的敏感性是64.3%和61.5%，特异性是95.7%和71.4%。本研究结果中，Mn抗原检测与上述研究相似，但相关抗体检测的敏感性较低，而二者联合检测，可以提高敏感性。作者推测，抗体检测敏感性低，可能与恶性血液病患者自身免疫功能紊乱、免疫力低下有关。因此，对于恶性血液病患者，念珠菌抗体检测不适合作为单独检测指标。

在回顾性分析162例Mn抗原、抗体联合检测的相关研究中，91例被证实为IC，敏感性77%，特异性51%[8]。作者发现联合检测的敏感性明显高于各项指标单独检测的敏感性。念珠菌抗原、抗体联合检测的AUC高于其他指标单独检测时的AUC，提示念珠菌抗原、抗体多重指标联合检测优于单独检测，可以更加敏感、准确地诊断IC。

恶性血液病患者由于自身疾病特点常伴随化疗后较长时间的中性粒细胞减少，这是真菌感染的高危因素。作者发现中性粒细胞缺乏组G试验和Mn抗原检测的阳性率均较低。以往研究[9]证实，念珠菌的细胞壁主要由两层构成，Mn主要富集于外层表面，而BG和甲壳素主要存在于内层。念珠菌侵犯至体内深部组织、器官时，被巨噬细胞吞噬或释放细胞因子，激活体内免疫系统而被清除[10]。检测时的BG和Mn抗原均为真菌细胞壁的代谢产物，由此可用于区分念珠菌定植和IC[11]。因此作者推测，体内中性粒细胞的缺乏也是真菌G试验和Mn抗原检测的假阴性因素之一。然而IgG、IgM抗体检测的敏感性并没有受到中性粒细胞缺乏的影响，据此念珠菌相关抗体检测可以弥补中性粒细胞缺乏期抗原检测敏感性不足的问题。

恶性血液病在治疗过程中，由于存在真菌感染的高危因素，造成超过51%的患者存在经验性抗真菌治疗，而其中75.6%的患者并没有诊断为IC[12]。而抗真菌药物的使用会抑制真菌的生长、阻滞真菌细胞壁的合成，造成检测结果的假阴性。作者根据研究对象抗念珠菌药物的使用情况，对比分析用药对念珠菌检测的影响，发现未用药组G试验检测阳性率高于用药组，与预期结果一致，提示抗真菌药物的使用确实影响到抗原的检测结果。而未用药组中Mn抗原的检测阳性率也高于用药组，但差异无统计学意义，可能为样本数量的影响。真菌抗体的检测并未受到抗真菌药物的影响，但敏感性较低。真菌抗原、抗体联合检测时用药组的检出率为82.9%，虽然与未用药组比较差异有统计学意义，但是可以很大程度上纠正预防性抗真菌药物使用对检测结果的影响。

恶性血液病患者是IC的高危人群，但由于念珠菌血清学检测自身方法学的限制，受到多个假阳性和假阴性因素的干扰，其抗原、抗体联合检测可以提高IC检测的敏感性和特异性，并克服临床治疗过程中常见的干扰因素，具有重要的临床价值。

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