荷芪散对多囊卵巢综合征大鼠内分泌代谢及PI3K/AKT信号通路的影响

赵恒侠，周道成，李惠林，张世茂，刘 媛，郑夏洁，陈 哲，张 卓

(1. 广东省深圳市中医院，广东 深圳 518033；2. 广州中医药大学第四临床医学院，广东 深圳 518033)

多囊卵巢综合征(PCOS)是以多病因和临床表现极不均一为主要特征的一种常见内分泌代谢综合征，至今病因和发病机制仍不明确。其典型的临床表现为不同程度的月经异常、不孕、多毛、痤疮、肥胖、卵巢多囊性改变等，并常伴随胰岛素抵抗(IR)、高血脂症和高胰岛素血症等[1]。有研究表明，PCOS卵巢局部IR与miRNA表达异常导致的PI3K/AKT信号通路传导障碍紧密相关[2]。荷芪散是自拟经验方，具有填精固肾、醒脾祛湿、行气化痰等功效，用于治疗多囊卵巢综合征不仅可降糖调脂，还可调节性激素水平，改善卵巢形态。本研究旨在通过观察荷芪散对PCOS大鼠模型糖脂代谢、性激素和卵巢形态以及PI3K/AKT信号通路基因表达量的影响，探讨其可能的作用机制。

1 实验资料

1.1动物及饲养 健康SPF级雌性SD大鼠60只，约21 d日龄，体质量(200±10)g，均由广州中医药大学实验动物中心提供，标准实验环境下饲养，自由摄水、摄食。普通饮水及基础饲料由广州永诺生物科技有限公司提供。

1.2主要药品 ①荷芪散复方制剂由深圳市中医院制备，由荷叶30 g、黄芪30 g、决明子30 g、山药15 g、桃仁10 g、石菖蒲10 g、制何首乌15 g、法半夏10 g、红花10 g、当归15 g、冬瓜皮15 g、仙茅15 g、淫羊藿15 g、菟丝子15 g、甘草5 g组成。生药由深圳市中医院中药房提供，并由深圳市中医院制剂室协助煎煮、过滤，浓缩成含生药8.1 g/mL的溶液。②二甲双胍(商品名：格华止，中美上海施贵宝制药有限公司)，用温热蒸馏水融化，并浓缩成含生药0.135 g/mL的溶液。③注射用脱氢表雄酮(DHEA)由湖北远成药业公司提供，注射用油由浙江田雨山药公司提供。

1.3主要试剂 血糖、血脂试剂盒由南京建成生物工程研究所提供；空腹胰岛素(FINS)、黄体生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)、睾酮(T)放免试剂盒由北京北方生物技术研究所提供。RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒及PCR引物合成均由日本Takara公司提供。

1.4主要仪器及设备 旋涡振荡器(海门市其林贝尔，vortex-5)，手提式高速分散器(宁波新芝，S10)，紫外可见分光光度计(上海奥谱勒仪器，UV-752P)，移液枪(Eppendorf)，电泳仪(Tanon，EPS300)，紫外透射分析仪(Hema,UV-3A)，电子天平(上海精密科学仪器，JA1003N)，实验室pH计(METTLER TOLEDO)，数显恒温水浴锅(江苏环宇科学仪器，HH-4)，冷冻高速离心机(Hema,TGL-16R)，手掌离心机(新庄医疗器械，XK-400)，冰箱(Siemens & Haier)，基因扩增仪(Hema，Hema9600)，Real-time Quantitative PCR(ABI，StepOne Plus)。

1.5分组、造模及干预 所有大鼠标准饲料适应性喂养2周后，随机选出15只大鼠作为正常组，每日颈背部皮下注射油剂0.2 mL/100 g，连续4周；剩下45只大鼠每日颈背部皮下注射DHEA溶液(DHEA溶于注射用油剂，浓度为30 mg/mL)0.2 mL/100 g进行造模，连续4周。全部大鼠每周称体质量1次。第10周龄大鼠阴道开口，取阴道涂片连续观察2个性周期(1个性周期为5 d)，观察各组大鼠动情周期变化。全部大鼠于第12周龄称体质量，眼眶后静脉取血、离心、分离血清，采用放射免疫法检测血清T、FINS。以阴道涂片连续出现角化细胞、失去完整动情周期、血清T、FINS水平异常升高判定为造模成功。将造模成功大鼠随机分为模型组、二甲双胍组、荷芪散组，每组15只。正常组和模型组大鼠给予生理盐水10 mL/(kg·d)灌胃，二甲双胍组给予二甲双胍浓缩液10 mL/(kg·d)灌胃，荷芪散组给予荷芪散溶液10 mL/(kg·d)灌胃，均连续灌胃8周，期间正常喂食，每周称体质量1次。

1.6血糖、血脂及性激素指标水平检测 实验结束时取血，酶学方法检测空腹血糖(FPG)、TC、TG、LDL-C、HDL-C水平，放射免疫法检测FINS、LH、FSH、T水平，按公式计算稳态模型胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)=(FPG×FINS)/22.5。

1.7卵巢组织HE染色 大鼠取血后处死， 每组中随机取10只大鼠卵巢小块薄组织(1 cm×0.5 cm×0.3 cm)于4%多聚甲醛溶液中固定24 h。随后经70%，80%，90%，100%乙醇逐级脱水，脱水程序为70%乙醇15 min，80%，90%，95%乙醇中各30 min，100%乙醇2 h并重复1次。用25%，50%，70%，90%二甲苯-无水乙醇透化各1 h。将标本浸入熔融的石蜡中浸蜡4 h，用加温的镊子将浸蜡的组织放入熔蜡中包埋，调整材料位置，待其移浮于水面并完全聚合。于旋转切片机上制备4 μm厚纵向切片，随后进行常规的HE染色观察卵巢组织。

1.8卵巢组织中PI3K/AKT信号通路传导分子mRNA相对表达量检测 每组余下大鼠完整取出双侧卵巢，去除表面的脂肪组织，置入液氮内保存。RT-PCR法检测卵巢组织中胰岛素受体底物-1(IRS-1)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶AKT-2(AKT-2)、糖原合成激酶-3β(GSK-3β)、葡萄糖转运蛋白因子-4(GLUT-4)、人第10号染色体缺失的磷酸酶(PTEN)mRNA相对表达量。用Applied Biosystems公司Prmier express软件设计引物。IRS-1引物序列：上游为5’-GTCTCGTGGCTGGGTGGA-3’，下游为5’-GGGCTCGCAGAAGTTAGGTG-3’，长度106 bp；AKT-2引物序列：上游为5’-CCATCCTTGTGCCCGAGAC-3’，下游为5’-CACCAGTGGCACATGCAAAC-3’，长度167 bp；GSK-3β引物序列：上游为5’-GGTGAAAATGCTTGGGTCG-3’，下游为5’-TGAAGGCAGTCTGTCGTAATAGC-3’，长度176 bp；GLUT-4引物序列：上游为5’-GATCGGCTCTGAAGATGGGG-3’，下游为5’-GGAGGAAATCATGCCACCCA-3’，长度182 bp；PTEN引物序列：上游为5’-AGACCATAACCCACCACAGC-3’，下游为5’-CAGGGCCTCTTGTGCCTTTA-3’，长度143 bp。反应体系组成:板cDNA 0.5 μL,SYBR Green PCR MasterMix 10 μL,Ps、Pa各0.5 μL(10 μmol/L),灭菌双蒸水补至20 μL。循环条件为:50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min,94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s。每次实验均设置阴性对照。目标基因的相对表达量计算公式： 2-△△Ct=2-[(△Ct)Test-(△Ct)Control]。Ct目的为目标基因Ct值，Ct管家为管家基因Ct值。△Ct= Ct目的-Ct管家，表示各样本目的基因相对管家基因的相对Ct值，△△Ct =(△Ct)Test-(△Ct)Control，表示处理组相对对照组进行归化，2-△△Ct表示处理组相对对照组的相对表达量，表示目标基因相对表达倍数。

2 结 果

2.1各组大鼠糖脂代谢指标比较 模型组FPG、FINS、HOMA-IR、TC、TG、LDL-C均明显高于正常组(P均<0.05)，HDL-C水平明显低于正常组(P<0.05)；荷芪散组、二甲双胍组FPG、FINS、HOMA-IR、TC、TG、LDL-C均明显低于模型组(P均<0.05)，而HDL-C变化不明显(P>0.05)；荷芪散组FPG、FINS、HOMA-IR与二甲双胍组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，TG、LDL-C均明显低于二甲双胍组(P均<0.05)，而TC明显高于二甲双胍组(P<0.05)。见表1。

2.2各组大鼠性激素指标水平比较 模型组血清LH、LH/FSH、T均明显高于正常组(P均<0.05)，FSH明显低于正常组(P<0.05)；荷芪散组、二甲双胍组血清LH、LH/FSH、T均明显低于模型组(P均<0.05)；荷芪散组LH、LH/FSH、T均明显低于二甲双胍组(P均<0.05)，FSH明显高于二甲双胍组(P<0.05)。见表2。

2.3各组大鼠卵巢组织切片HE染色情况 光镜下观察正常组卵巢组织结构正常，可见部分发育阶段卵泡，卵泡内可见蛋白性液体，黄体结构正常，泡膜细胞层无增生现象,见图1；模型组卵巢组织中卵泡囊性扩张，内含卵泡液，黄体数量减少，结构疏松紊乱，泡膜细胞层出现明显增生现象，见图2；荷芪散组、二甲双胍组卵巢组织中囊性卵泡明显较模型组少，黄体数量增多，排列尚规则，增生的泡膜细胞层变薄，见图3及图4。

表1 各组大鼠糖脂代谢指标比较

注：①与正常组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05；③与二甲双胍组比较，P<0.05。

表2 各组大鼠性激素指标水平比较

注：①与正常组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05；③与二甲双胍组比较，P<0.05。

图1 正常组大鼠卵巢组织切片HE染色(×100)

图2 模型组大鼠卵巢组织切片HE染色(×100)

2.4各组大鼠卵巢组织中IRS-1、AKT、GSK-3β、GLUT-4、PTEN mRNA相对表达量比较 模型组大鼠卵巢组织中IRS-1、AKT、GSK-3β、GLUT-4 mRNA相对表达量均明显低于正常组(P均<0.05)，PTEN mRNA相对表达量明显高于正常组(P<

图3 荷芪散组大鼠卵巢组织切片HE染色(×100)

图4 二甲双胍组大鼠卵巢组织切片HE染色(×100)

0.05)；荷芪散组、二甲双胍组大鼠卵巢组织中IRS-1、AKT、GSK-3β、GLUT-4 mRNA相对表达量均明显高于模型组(P均<0.05)，PTEN mRNA相对表达量均明显低于模型组(P均<0.05)；荷芪散组大鼠卵巢组织中IRS-1、AKT、GSK-3β、GLUT-4 mRNA相对表达量均明显高于二甲双胍组(P均<0.05)，PTEN mRNA相对表达量明显低于二甲双胍组(P<0.05)。见表3。

3 讨 论

表3 各组大鼠卵巢组织相关基因相对表达量比较

注：①与正常组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05；③与二甲双胍组比较，P<0.05。

PCOS是一种因下丘脑-垂体-卵巢轴代谢紊乱引起机体代谢异常和生殖功能障碍的内分泌疾病，其发病和IR有非常紧密的联系[3]。目前西医对该病尚无特效疗法，而中医治疗该病有一定优势。罗金等[4]研究发现黄芪多糖联合达英-35可有效改善PCOS患者IR和高雄激素状态及血脂代谢，并能使患者卵巢体积减小，停药后大部分有规律月经。相关临床及实验研究表明，活血化瘀和化痰药具有促进盆腔微循环，增加子宫和卵巢血液供应，降低卵巢包膜厚度，促进排卵及黄体发育以及降低胰岛素水平的作用[5-8]；补肾药物可以通过调节下丘脑-垂体-卵巢性腺功能，降低雄激素水平及改善IR，从而逆转卵巢多囊样改变[9-10]。

荷芪散为深圳市中医院经验方，具有健脾祛湿、升清降浊、通便瘦身之效。方中黄芪补中益气、健脾利水，为君药；荷叶利湿化瘀，祛痰利水，升发清阳，为臣药。决明子利水通便；制何首乌补肝益肾；山药平补三焦，健脾益胃，填精固肾；冬瓜皮利水消肿；石菖蒲化痰瘀，消湿浊，利水湿；法半夏燥湿化痰，消痞散结；桃仁、红花活血化瘀，通经止痛；当归活血调经，补血止痛；仙茅、淫羊藿补肾助阳，祛风除湿；菟丝子补肾益精，养肝安胎，俱为佐使药。全方共奏填精固肾、醒脾祛湿、行气化痰之功,为脾肾亏虚、痰瘀互结之首选。本课题组前期研究发现，荷芪散可明显降低肥胖患者体质量，改善脂代谢，并且能减轻代谢综合征患者胰岛素和瘦素抵抗，纠正慢性炎症状态，提高胰岛素敏感性[11-14]。该方临床用于PCOS合并IR患者疗效较好，能显著改善IR和内分泌紊乱。本实验结果显示，荷芪散组、二甲双胍组FPG、FINS、HOMA-IR、TC、TG、LDL-C、LH、LH/FSH、T均明显低于模型组，且荷芪散组TG、LDL-C、LH、LH/FSH、T均明显低于二甲双胍组，而TC、FSH明显高于二甲双胍组；荷芪散组、二甲双胍组大鼠卵巢组织接近正常。提示荷芪散可改善PCOS模型大鼠的糖脂代谢和卵巢组织形态，减轻IR，纠正性激素紊乱状态。

目前研究表明IRS-1在相关信号传导过程中优先调节MAPK/ERK途径，并通过激活转录因子增加细胞周期蛋白的基因表达，促进蛋白合成和细胞增殖[15]。磷酸化的IRSs导致二聚体构象的改变，激活并活化PI3K，继而形成PIP3，PIP3与蛋白激酶B(PKB)和重组人丙酮酸脱氢酶激酶同工酶-1(PDK-1)结合，最终活化AKT-2[16]。AKT是PI3K下游的直接靶蛋白，被PI3K激活后可以使GSK-3β发生磷酸化而失活，不能抑制糖原合成酶的活性，进而间接促进糖原合成；同时GSK通过减少IRS-1丝氨酸磷酸化，可抑制胰岛素信号的传导[17-19]。另外，在胰岛素刺激下，靶细胞内的GLUT-4由细胞内的贮存室移位到细胞膜上，完成葡萄糖从细胞外向细胞内的跨膜转运[20]。PTEN是PI3K信号通路的负调节因子，可控制颗粒细胞的增殖，控制卵巢的正常排卵功能，能够促进PIP3转化为PIP2，抑制蛋白激酶AKT的表达，阻断下游信号通路。本实验结果显示，模型组大鼠卵巢组织中IRS-1、AKT、GSK-3β、GLUT-4 mRNA相对表达量均明显低于正常组，PTEN mRNA相对表达量明显高于正常组；荷芪散组大鼠卵巢组织中IRS-1、AKT、GSK-3β、GLUT-4 mRNA相对表达量均明显高于模型组，PTEN mRNA相对表达量均明显低于模型组。这说明多囊卵巢综合征可能导致局部卵巢组织PI3K/AKT信号通路中相关重要信号传导分子基因表达量的紊乱，而荷芪散可以重新上调IRS-1、AKT-2、GSK-3β、GLUT-4基因表达，下调拮抗因子PTEN基因表达。

综上所述，荷芪散能通过上调局部卵巢组织PI3K/AKT信号通路中相关重要信号传导分子如IRS-1、AKT-2、GSK-3β、GLUT-4的基因表达，下调拮抗因子PTEN的基因表达，改善PCOS模型大鼠糖脂代谢和卵巢组织形态，降低胰岛素水平，减轻IR，纠正性激素紊乱状态。

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