猕猴桃中甲基硫菌灵和异菌脲HPLC测定方法研究
2018-02-01刘志刚刘伟余磊谢晓林刘晓燕高蓬明马和乔
刘志刚,刘伟,余磊,谢晓林,刘晓燕,高蓬明,马和乔
(1.贵阳学院食品与制药工程学院,贵州贵阳550005;2.贵州省果品加工工程技术研究中心,贵州贵阳550005)
甲基硫菌灵(Thiophanate-methyl)又称甲基托布津,属于高效、低毒杀菌剂,具有内吸和预防作用,广泛用于治疗各种经济作物的白粉病、菌核病、灰霉病等,对人体有潜在致甲状腺癌的危害。异菌脲(Iprodione)又称扑海因,是广谱保护性杀菌剂,可以防治各种作物的黑穗病、黑痣病、赤星病等病害,其能在人体的胃内产生硝化反应,形成硝基化合物而使人中毒。
猕猴桃富含多种营养素,具有增强免疫力、预防心脑血管疾病等多种生理活性功能,享有“水果之王”的美誉[1],是近年来贵州省重点发展的特色农产品之一。猕猴桃在生长过程中极易侵染软腐病,导致在贮藏过程中发病,造成大量烂果,软腐病已成为我国猕猴桃主产区种植业发展的重要制约因素[2]。病理研究发现猕猴桃软腐病的主要致病菌为葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)和拟菌点霉菌(Phomopsissp.)[3],该病害侵染时期为花期和坐果期,主要途径为疏花、疏果后害虫造成创口侵染,目前主要采用甲基硫菌灵和异菌脲等农药进行防控,但过量的甲基硫菌灵和异菌脲会对人体产生潜在的危害。有文献报道了采用紫外分光光度法、HPLC法和LC-MS法分别对甜瓜等果蔬中的甲基硫菌灵和异菌脲进行了含量测定[4-11],目前鲜见采用HPLC法同时测定猕猴桃中甲基硫菌灵和异菌脲含量的文献报道。本研究采用乙腈涡旋提取样品,建立了快速、专属的HPLC法同时测定猕猴桃中甲基硫菌灵和异菌脲含量,对猕猴桃鲜果及相关加工产品的质量控制具有参考价值。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
猕猴桃样品采自贵州省修文县龙场镇平滩村“贵长”猕猴桃种植基地。
甲基硫菌灵(HPLC级):上海阿拉丁股份有限公司(Lot:F1228011);异菌脲(HPLC 级):百灵威科技有限公司(Lot:24904);乙腈和甲醇(色谱纯):美国 Tedia公司;甲酸(分析纯):天津市科密欧化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
LC-15C型高效液相色谱仪、配二极管阵列检测器、Labsolution色谱工作站、AUW-120D型电子天平、UV2700型紫外可见光光谱仪:日本岛津公司;KQ5200DB型数控超声波清洗器:昆山市超声仪器有限公司;TGL-16A型台式高速冷冻离心机:长沙平凡仪器仪表有限公司;SHA-B型恒温振荡器:常州澳华仪器有限公司。
1.3 样品制备方法
1.3.1 标准溶液制备
准确称取甲基硫菌灵标准品0.010 2 g,加乙腈溶解并定容至100 mL量瓶,即为甲基硫菌灵标准贮备液。另准确称取异菌脲标准品0.010 5 g,加乙腈溶解并定容至100 mL量瓶,即为异菌脲标准贮备液。分别精密量取甲基硫菌灵和异菌脲储备液各8.0 mL,用乙腈稀释成浓度分别为8.16 μg/mL和8.40 μg/mL的混合标准溶液,经0.45 μm微孔滤膜过滤,备用。
1.3.2 供试品溶液制备
将猕猴桃表皮及果肉分离,称取果肉5.0g于25mL PE离心管中,分别加入10 mL乙腈,涡旋30 s,在常温下超声20 min后将离心管在离心机上(10 000 r/min)离心5 min,再加入5 mL乙腈洗残渣,合并2次提取液并用乙腈定容至25 mL量瓶中,经0.45 μm微孔滤膜过滤,备用。
1.4 HPLC色谱条件
色谱柱 Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm×5 μm),流动相为乙腈∶0.05%甲酸水溶液=60∶40(体积比),等浓度洗脱,柱温为30℃;进样体积 20 μL;流速1.0 mL/min;检测波长210 nm。
2 结果与分析
2.1 标准曲线的绘制
精密吸取浓度分别为10.2 μg/mL和10.5 μg/mL的甲基硫菌灵和异菌脲混合标准溶液适量,依次稀释成浓度为 0.204、0.510、1.02、2.04、5.10、10.2 μg/mL 和0.210、0.525、1.05、2.10、5.25、10.5 μg/mL 的系列标准溶液,经0.45 μm微孔滤膜过滤,进样。以浓度C(μg/mL)为横坐标,峰面积A为纵坐标,分别绘制标准曲线(见图1),得到甲基硫菌灵回归方程为y=99 684x-7 643.1(R2=0.999 2),异菌脲回归方程为y=141 238.835 6x-6 868.9(R2=0.999 7)。
图1 甲基硫菌灵和异菌脲标准曲线图Fig.1 The standard curve of thiophanate-methyl and iprodione
2.2 精密度试验
取浓度分别为8.16 μg/mL和8.40 μg/mL的甲基硫菌灵和异菌脲混合标准溶液,在1.4色谱条件重复进样6次,甲基硫菌灵和异菌脲标准品代表色谱图见图2。甲基硫菌灵的峰面积分别为997 251、999 082、991 500、997 857、974 397 和 978 238,异菌脲的峰面积分别为 1 412 693、1 413 582、1 403 610、1 408 569、1 381 034和1 393 262,计算得RSD分别为1.04%和0.95%,说明方法精密度良好。
图2 甲基硫菌灵和异菌脲标准品色谱图Fig.2 Chromatograms of thiophanate-methyl and iprodione standard
2.3 检出限
分析方法的检出限为3倍S/N时对应的待分析物浓度,经试验并按实际样品的处理过程计算得到甲基硫菌灵和异菌脲的检测限均为0.05 μg/g。
2.4 回收率与重复性试验
准确称取未施用甲基硫菌灵和异菌脲的猕猴桃样品6份,分别按照3个浓度准确加入甲基硫菌灵和异菌脲对照品各3份,按照1.3.2方法制备供试品溶液,猕猴桃样品添加甲基硫菌灵和异菌脲标准品代表色谱图见图3。计算加样回收率,甲基硫菌灵和异菌脲回收率结果分别见表1和表2,结果表明所建立方法的回收率和重复性较好。
图3 猕猴桃样品添加甲基硫菌灵和异菌脲标准品色谱图Fig.3 Chromatograms of kiwifruit sample added with thiophanate-methyl and iprodione standard
表1 甲基硫菌灵回收率试验结果Table 1 The result of recovery of thiophanate-methyl
表2 异菌脲回收率试验结果Table 2 The result of recovery of iprodione
2.5 稳定性试验
取甲基硫菌灵和异菌脲混合标准溶液适量,在室温下放置 0、2、4、6、8、10、12 h 后,在确定的色谱条件下进样,测定甲基硫菌灵和异菌脲的色谱峰面积,分别计算RE值,由表3中结果可知,甲基硫菌灵和异菌脲溶液在室温下放置12 h稳定。
表3 甲基硫菌灵和异菌脲稳定性试验结果Table 3 The result of stability of thiophanate-methyl and iprodione
2.6 样品测定
按上述样品前处理方法和高效液相色谱条件,对采自贵州省修文县龙场镇平滩村“贵长”猕猴桃种植基地的6个不同批次“贵长”猕猴桃中甲基硫菌灵和异菌脲含量进行检测,结果均未检出。
3 结论
本研究建立了猕猴桃中甲基硫菌灵和异菌脲两种农药的HPLC测定方法,甲基硫菌灵和异菌脲的检出限均为0.05 μg/g,方法的专属性和准确度良好,能够用于检测猕猴桃样品中上述两种农药的残留。对采自贵州省修文县龙场镇平滩村“贵长”猕猴桃种植基地的6个不同批次“贵长”猕猴桃中甲基硫菌灵和异菌脲含量进行检测(该批次猕猴桃均采用甲基硫菌灵和异菌脲防控软腐病),结果均未检出,检测结果表明,采用甲基硫菌灵和异菌脲防控制猕猴桃软腐病造成猕猴桃果实中上述两种农药残留的风险较小。
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