响应面法优化小球藻多糖提取工艺研究

史瑞琴，李大伟，梁静静，王颉，马艳莉

（河北农业大学食品科技学院，河北保定071000）

小球藻（chlorella）属于绿藻门小球藻属的单细胞绿藻，具有光合能力强、分布范围宽、繁殖快以及应用价值高等特点[1-2]。我国目前常见的普通小球藻细胞内含有可观碳水化合物、蛋白质以及多种维生素，是一种天然的营养均衡的食物来源，而小球藻多糖具有很强的生物活性，如：调免疫、降血脂、降血糖等，可用于临床医学、保健食品研发以及化妆品研制等[3]。

植物多糖常与脂质、蛋白质等结合形成结构复杂的多糖混合物，使多糖的高效提取造成一定困难[4-5]，而且单一使用酸、碱提法，超声波法，微波法等都会损失一定量的多糖，所以研究两种或多种提取方法的有效结合对植物多糖的提取具有重大意义。早期，多糖的提取采用提取效率极低的水提醇沉法[6]，而近年来随着酶技术、超声波技术以及微波技术[7-8]的不断深入研究，使得这些方法在实践中成功应用。酶技术与超声波技术的有效结合可加速原料中多糖溶入溶剂，从而进一步使多糖的提取率增加[9]。因此，使用超声波结合复合酶提取小球藻多糖、提高小球藻多糖的提取率对开发小球藻资源具有重大意义。本试验采用单因素和响应面法优化小球藻多糖提取工艺，为研发小球藻多糖保健品确立了理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

小球藻粉：西安百川生物科技有限公司；木瓜蛋白酶（酶活力≧60万单位/克）和纤维素酶（酶活力≧3千单位/克）：北京索莱宝科技有限公司；氢氧化钠（NaOH）、苯酚（C6H5OH）：上海市沃凯生物技术有限公司；95%乙醇（C2H5OH）：石家庄新宇三阳有限公司；浓硫酸（H2SO4）：河南开化化工产品经销有限公司；葡萄糖（C6H12O6）：山东天力化学试剂有限公司。

AR423CN电子天平、STARTER 2100实验室pH计：奥豪斯（上海）仪器有限公司；H.SWX-600BS电热恒温水浴箱：常州朗博仪器制造有限公司；SK5200H超声波清洗器：广州科导仪器设备有限公司；Neofuge15R高速冷冻离心机：上海力申科学仪器公司；DHG-9143B5-Ⅲ电热恒温鼓风干燥机：上海新苗医疗制造有限公司；752型紫外分光光度计：上海青华科技仪器有限公司；DL-1万用电炉：北京中兴伟业仪器有限公司。

1.2 工艺流程

称取小球藻粉1 g→加适量蒸馏水→超声30 min→调pH→加酶→酶解30 min→灭酶→热水浸提（70℃，4 h）→离心（4 500 r/min，0℃，15 min）→过滤取上清液→添加3倍体积95%乙醇→4℃静置过夜→离心（4 500 r/min，0℃，15 min）→烘干→粗多糖

1.3 小球藻多糖含量测定

1.3.1 葡萄糖标准曲线的绘制

分别吸取 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 的标准葡萄糖溶液（0.1 mg/mL）置于25 mL试管中，加蒸馏水补至2.0 mL。编号0-6号，分别添加1.0 mL 6%苯酚溶液与5.0 mL浓硫酸，在自然条件下反应5 min并经过沸水浴10 min后冷却到室温。将0号作为对照，在490 nm处测定其的吸光度。分别以葡萄糖浓度、吸光度值为横、纵坐标，制作葡萄糖含量的标准曲线。得到的标准曲线回归方程为：Y=13.142 86X-0.002，R2=0.999 6。

1.3.2 样品测定与分析

对干燥后的小球藻多糖进行溶解并稀释至合适浓度之后，用苯酚硫酸法[10]测定小球藻多糖含量，多糖提取率为[11]：

多糖含量/%=（测量浓度×稀释倍数×反应液体积/粗多糖的质量）×100

多糖提取率/%=（粗多糖的质量/原料质量）×100

1.4 单因素试验

为了探究复合酶对小球藻多糖提取率的影响，首先应确定复合酶的作用效果是否比单一酶的效果好，为此设定反应条件：液料比 25∶1（mL/g），pH 值 5，酶解温度50℃。然后分别选择不同添加量的纤维素酶、木瓜蛋白酶以及2种酶的复合酶，对小球藻藻液持续酶解30 min，对溶液处理后，测定小球藻多糖的提取率。

选用优化后的酶种类及添加量，控制其他反应条件，如：pH 值5、50℃酶解，测定不同液料比 10∶1、15∶1、20 ∶1、25 ∶1、30 ∶1（mL/g）时小球藻多糖的提取率；依据其结果选择最优组合，控制酶解温度50℃，分别测定 pH3、4、5、6、7 时小球藻多糖的提取率；择其最优组合，测定酶解温度为 30、40、50、60、70 ℃时小球藻多糖的提取率。每个试验重复3次。

1.5 响应面优化试验

在单因素试验的基础上，以液料比（A），复合酶添加量（B），pH 值（C），酶解温度（D），小球藻多糖提取率为自变量和唯一响应值，按照Box-Behnken的中心组合设计规律，采用四因素三水平的响应面法操作试验，并优化小球藻多糖的提取条件。分析因素及水平见表1。

表1 因素水平取值和编码表Table 1 Factor level values and coding tables

1.6 数据处理与分析

本试验主要通过Origin Pro 7.5对数据进行处理与分析，并用Design-Expert 8.05软件处理分析试验结果，依据F值考察二次回归模型及因素的显著性（P＜0.05）。

2 结果分析

2.1 复合酶法提取小球藻多糖的单因素试验

2.1.1 酶种类和添加量对小球藻多糖提取率的影响

酶种类和添加量对小球藻多糖提取率的影响见表2。

表2 酶种类和添加量对小球藻多糖提取率的影响Table 2 Effects of enzyme types and amount on extraction rate of polysaccharide from chlorella

续表2 酶种类和添加量对小球藻多糖提取率的影响Continue table 2 Effects of enzyme types and amount on extraction rate of polysaccharide from chlorella

由表2可见，使用酶的种类不同，小球藻多糖的提取率也不同，但小球藻多糖得率的变化趋势基本相同，都是当酶的添加量增加时而随之增大，到达一定程度后稍有降低。单独使用一种酶或使用复合酶的添加量为1.5%时，小球藻多糖的提取率均达到最高。其中使用1.5%的复合酶时，小球藻多糖的提取率最大（5.25%）。因此，本试验拟定使用复合酶进行试验。

2.1.2 复合酶添加量对小球藻多糖提取率的影响

复合酶添加量对小球藻多糖提取率的影响见图1。

图1 复合酶添加量对小球藻多糖提取率的影响Fig.1 Effect of compound enzyme amount on extraction rate of polysaccharide from chlorella

由图1可得，多糖提取率在酶添加量增大时呈现出上升趋向，而且在酶的添加量为0.5%到1.5%时增长较快，到达1.5%后缓慢降低。出现这种变化趋势的原因可能是添加适量酶时可促进多糖的溶解，但是当添加过量酶时底物反应完全后，酶会进一步分解糖苷键，导致小球藻多糖提取率降低。因此选取1.5%为适宜的复合酶添加量。

2.1.3 液料比对小球藻多糖提取率的影响

液料比对小球藻多糖提取率的影响见图2。

图2 液料比对小球藻多糖提取率的影响Fig.2 Effect of the ratio of solvent to material on extraction rate of polysaccharide from chlorella

由图 2可得，当液料比例为 20∶1（mL/g），小球藻多糖的得率达到最大，之后随着液料比的增大小球藻多糖的得率趋于稳定。表明当液料比为20∶1（mL/g）时多糖基本已溶出充分。因此选取20∶1（mL/g）的液料比。

2.1.4 pH值对小球藻多糖提取率的影响

酶解pH值对小球藻多糖提取率的影响见图3。

图3 酶解pH值对小球藻多糖提取率的影响Fig.3 Effect of pH value on extraction rate of polysaccharide from chlorella

由图3可得，当pH值过小时会对小球藻多糖的得率造成较大的影响，当pH值为5.0时，小球藻多糖的得率最大，随后pH值持续增大时，多糖的得率反而降低。这可能是由于两种酶的最适pH值均偏酸性，当溶液pH值为中性时，酶的活性降低影响小球藻多糖的提取率。综上所述，试验比较适宜的pH值为5.0。

2.1.5 酶解温度对小球藻多糖提取率的影响

酶解温度对小球藻多糖提取率的影响见图4。

由图4可得，当进行40℃酶解时，小球藻多糖的提取率达到顶峰。当酶解温度小于40℃时，小球藻多糖提取率随酶解温度的提高而随之增大，这可能是因为酶解温度增大时，反应物与底物分子之间的碰撞越强烈，反应物与酶之间互相接触的几率大大提高。但当酶解温度达到40℃后，在高温条件下，酶的化学结构遭到破坏，导致酶活性降低，从而使小球藻多糖的提取率降低。综上所述，40℃为比较适宜的酶解温度。

图4 酶解温度对小球藻多糖提取率的影响Fig.4 Effect of enzymatic temperature on extraction rate of polysaccharide from chlorella

2.2 小球藻多糖提取的响应面结果分析

2.2.1 响应面试验设计及结果

在单因子试验基础上，选择液料比（A）、复合酶添加量（B）、pH（C）、酶解温度（D）4个变量，并采用响应面法优化复合酶法提取小球藻多糖的条件，其结果如表3所示。

表3 Box-Behnken试验设计及结果Table 3 Box-Behnken test design and results

续表3 Box-Behnken试验设计及结果Continue table 3 Box-Behnken test design and results

通过对实验数据分析，可得小球藻多糖提取率的二次多项回归方程：

Y=6.56-0.075A-0.060B+0.41C-0.13D-0.11AB+0.49AC-0.12AD-0.14BC-0.010BD-0.073CD-0.32A2-0.47B2-1.08C2-0.61D2

式中：Y为小球藻多糖提取率。对该模型的方差及显著性进行分析，结果见表4。

表4 二次回归方程方差分析Table 4 Analysis of variance the regression model

由表4可以得出，二次多项的回归项P值为0.002 6，差异显著（P＜0.05），失拟项 P 值为 0.234 1，不显著（P＞0.05）。所以该模型的拟合度较高，可以用于对二次回归方程的相应值进一步预测；此外，该模型的决定系数R2=0.830 7，表明预测值与真实值有较高的相关性；而变异系数CV=0.134 5，说明试验可操作性较好。综上述分析可知，此模型可以用来分析和预测小球藻多糖提取率的真实情况。每种因子对小球藻多糖得率的影响程度为：pH＞酶解温度＞液料比＞复合酶添加量。

2.2.2 响应面分析

按照回归模型绘制响应曲面三维图，从而清晰地呈现出料液比、复合酶添加量、pH、酶解温度对小球藻多糖得率的影响，其结果如图5～图10所示。

图5 复合酶添加量与液料比对提取率的响应面图Fig.5 Effects of compound enzyme amount and ratio of solvent to material on extraction ratio

图7 酶解温度与液料比对提取率的响应面图Fig.7 Effects of enzymolysis temperature and ratio of solvent to material on extraction ratio

图8 pH与复合酶添加量对提取率的响应面图Fig.8 Effects of pH and compound enzyme amount on extraction ratio

图9 酶解温度与复合酶添加量对提取率的响应面图Fig.9 Effects of enzymolysis temperature and compound enzyme amount on extraction ratio

图10 酶解温度与pH对提取率的响应面图Fig.10 Effects of enzymolysis temperature and pH on extraction ratio

响应曲面图可以表示试验因素的每个水平之间与响应值的函数关系，同时可直观的获取试验设计中的最优工艺参数。由图5～图10可知，料液比与pH的交互作用显著，pH与复合酶添加量、液料比与酶解温度、料液比与复合酶添加量、pH与酶解温度之间的交互作用依次降低，复合酶添加量与酶解温度之间的交互作用最小。通过对响应面图的陡峭程度分析可知，pH对小球藻多糖得率的影响最大，酶解温度与液料比对其影响相对较小，而复合酶添加量的影响最低，这与前面方差分析结果一致。

2.2.3 最佳提取工艺条件的预测与验证

经响应面法优化，软件Design-Expert.V8.0分析得复合酶法提取小球藻粗多糖的最佳的条件为液料比20.48∶1、复合酶添加量1.45%、pH值5.22、酶解温度38.76℃，此条件下小球藻多糖提取率的预测值为6.617%。为使得现实中更加便捷地进行试验，将上述预测的最佳条件修改为液料比20∶1（mL/g）、复合酶添加量1.45%、pH值5以及酶解温度39℃。为检验模型是否可靠，对上述修改后的提取条件做3次重复验证试验，小球藻多糖提取率平均为6.56%，实际值和预测值的相差为0.52%。证明所建立的模型对预测小球藻多糖得率是准确可行的。

3 结论

本试验通过对不同液料比的小球藻藻粉溶液进行超声波处理后，使用复合酶法对小球藻多糖进行浸提，选取料液比、复合酶添加量、pH值和酶解温度执行单因素试验，并确定各水平后使用响应面优化提取条件，即小球藻多糖的最佳提取条件为：液料比20∶1（mL/g）、复合酶添加量1.45%、pH值5、酶解温度为39℃。本试验为小球藻多糖的提取方法及提取条件提供了一定的理论参考。

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