chi-miR-4110对奶山羊 Smad2基因的靶向调控作用

侯金星，雷颖楠，梁玉发，安小鹏，宋宇轩，曹斌云，李云甫，张 周

(1.杨凌职业技术学院 动物工程分院，陕西杨凌 712100；2.西北农林科技大学 动物科技学院,陕西杨凌 712100；3.新野县动物疾病预防控制中心，河南新野 473500)

繁殖性状是奶山羊的重要经济性状。研究发现繁殖性状不仅受神经内分泌系统和卵巢的细胞因子所调控，而且也受到microRNAs(miRNAs)的调控作用。miRNA的生物合成由RNA聚合酶Ⅱ启动转录，由核内核糖核酸酶Ⅲ Drosha和其辅酶DGCR8将初始模板(pri-miRNA)转化为发夹样复合物(pre-miRNA)。pre-miRNA随后被出核蛋白5(Exportin 5)转运入细胞质内，由第二种核糖核酸酶Ⅲ Dicer转化为约22 nt的成熟miRNA[1-3]，广泛存在于动植物基因组中，与基因表达调控相关[4-6]。它通常与靶基因mRNA完全或不完全匹配结合，诱导靶mRNA降解或阻遏其转录后翻译，影响细胞增殖、分化和凋亡，在动物繁殖过程中起至关重要的作用[7-9]。目前在牛和羊的卵巢中发现多个miRNA，例如miR-204、 miR-29a和miR-199等[10-12]。测序技术的发展极大地提高了miRNA的发现速度，多个物种的miRNA序列已被测定并公布[13-14]。迄今为止，miRNA数据库(Release 21.0，http:∥www.mirbase.org/index.shtml)中牛的成熟miRNA有793个，山羊有436个，猪有411个，绵羊有153个。miRNA的表达具有发育阶段性和组织特异性，通过序列特异性的碱基配对抑制mRNA的翻译，在转录后水平调控基因的表达。研究发现，miRNA在卵巢发育颗粒细胞、排卵期功能调节、性腺激素合成以及黄体化过程中发挥重要作用。研究表明，miR-93可以促进卵巢颗粒细胞的增殖[15]；miR-378通过调节卵丘细胞中的芳香酶基因表达，调节卵母细胞的成熟[16]。研究人员通过基因芯片技术发现51个miRNA能抑制颗粒细胞产生雌二醇[17]。miR-21、miR-132 和miR-212 通过调控促黄体素的分泌影响小鼠卵母细胞的成熟和排卵[18]。对体外培养的颗粒细胞的研究表明，miR-378以性激素环化酶为靶点直接降低雌激素分泌[19]。这些研究表明miRNA在卵泡生长发育成熟等生理过程中起重要作用。

本研究在前期构建的多羔(1胎3～5羔)和单羔(1胎1羔)关中奶山羊发情期卵巢差异表达miRNA文库的基础上，筛选在单羔奶山羊中显著高表达的chi-miR-4110并推测其参与奶山羊的繁殖过程，利用生物信息学、qRT-PCR和Western blot等技术验证chi-miR-4110的靶基因及其对靶基因的调控作用，揭示chi-miR-4110对奶山羊繁殖机能的调控作用，为提高奶山羊繁殖性能提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

卵巢组织样采自杨陵上洛手村的奶山羊屠宰厂。采集时，将新鲜卵巢浸泡在灭菌后的PBS溶液中，放入冰盒，立即带回细胞间处理，卵巢颗粒细胞的分离参照Peng 等[20]的方法。

1.2 试剂及仪器

Opti-MEMⅠ、胰蛋白酶、胎牛血清、DMEM 培养基购自 Gibco 公司，DMSO(二甲基亚砜)、TRIzol试剂、Lipofectamine 2000 转染试剂盒购自美国Invitrogen公司，琼脂糖凝胶回收试剂盒购自北京天根生化科技有限公司，反转录试剂盒购自 Fermentas 公司，RT-qPCR试剂盒购自日本 TaKaRa 公司，双荧光素酶检测试剂盒购自美国 ABI 公司，BCA 蛋白定量试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司，PCR 扩增仪购自美国 ABI 公司，实时定量仪器购自美国 Bio-rad 公司。

1.3 细胞培养和RNAs提取

奶山羊卵巢颗粒细胞和人肾上皮细胞 293T 使用含φ=10% 胎牛血清的 DMEM-F12 培养基在37 ℃、φ=0.5% CO2的条件下培养[21]。用TRIzol法提取奶山羊卵巢颗粒细胞总 RNA。用核酸定量仪检测 RNA 的质量和质量浓度。

1.4 Smad2基因3′UTR片段的克隆

利用Targetscan、miRBase、RNAhybrid 2.1数据库预测chi-miR-4110的靶基因是 Smad2。根据GenBank中山羊 Smad2基因3′UTR序列，利用Primer 5.0软件设计上、下游引物(表1)，在上、下游引物的5′端加上XhoⅠ和NotⅠ内切酶的酶切位点，并在酶切位点前加2～3个保护碱基。引物由上海生物技术工程公司合成。根据引物的退火温度设置范围(56 ℃～63 ℃)，进行梯度PCR试验，筛选最适退火温度进行PCR扩增，并纯化回收PCR凝胶产物，将纯化回收的目的片段连接到pMD19-T连接载体上，将重组载体转入到感受态细胞(大肠杆菌DH5α)中涂板培养，将阳性单克隆扩大培养后，吸取1 mL送至上海生物技术工程有限公司测序，测序结果用Blast对比分析，筛选含有目的基因的阳性载体。

表1 Smad2-3′UTR的引物序列Table 1 Primer sequence of Smad2-3′UTR

注：下划线的碱基为酶切位点，斜体的碱基为保护碱基。

Note：Underlined bases are cleavage site,and protective bases are italic.

1.5 双荧光素酶活性检测

将PCR扩增的 Smad2基因 3′UTR片段和psiCHECK-2载体分别进行双酶切(XhoⅠ和NotⅠ)，然后将纯化回收得到的 Smad2-3′UTR片段和载体psiCHECK-2用T4连接酶连接，将重组载体转入到感受态细胞(DH5α)中涂板培养，将阳性单克隆扩大培养后，吸取1 mL送至上海生物技术工程有限公司测序，测序结果用Blast对比分析，筛选含有目的基因的阳性载体。

取对数生长期 293T细胞接种于24孔板，将chi-miR-4110 mimics(序列UAGCAGCACAGAAAUGUUGGUA)或阴性对照(Negative control,NC)与构建的psiCHECK2- Smad2-3′UTR质粒共转染293T细胞，转染分为3组，试验组1： Smad2-3′UTR+chi-miR-4110 mimics (SRM)；对照组1： Smad2-3′UTR (SR)；对照组2： Smad2-3′UTR+ NC(SNC)。转染步骤参照Lipofectamine 2000试剂盒说明书进行。转染36 h 后，用裂解缓冲液PLB裂解细胞并检测其荧光强度。使用多功能酶标仪测定荧光素酶的活性，每次检测试验分别进行独立的3次重复，用萤火虫荧光素酶活性校正海参荧光素酶活性。

1.6 Smad2基因mRNA表达量的检测

根据 GenBank中山羊 Smad2 基因的mRNA序列，用Primer 5.0设计实时定量PCR引物(RT-qPCR)，引物信息见表2。以GAPDH为内参基因，用SYBR Primer ExTaqII (TaKaRa) 试剂盒检测mRNA的相对表达量。每个样品3个重复，反应体系为20 μL：12.5 μL Platinum RTS SYBR Super Mix，1 μL Forward Primer，1 μL Reverse Primer，1 μL cDNA模板，4.5 μL DNAase-free dH2O。用2-ΔΔCt法分析 Smad2 基因的mRNA相对表达量。

表2 RT-qPCR引物信息Table 2 Primer sequence of RT-qPCR

1.7 Western blot检测

将Lipofectamine 2000分别与chi-miR-4110 mimics、NC和chi-miR-4110抑制剂(nhibitor)及抑制剂阳性对照物(inhibitor NC)混匀后，转染奶山羊卵巢颗粒细胞，转染步骤参照Lipofectamine 2000试剂盒说明书进行，培养48 h后，收集细胞提取蛋白。用SDS-PAGE凝胶电泳对提取的蛋白进行Western blot检测。用凝胶图像处理系统分析目标条带，用ImageJ2X对其成像结果进行灰度分析。

1.8 数据分析

使用SPSS 17.0软件进行统计分析，数据以“平均值±标准差”表示，组间差异显著性标准为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 chi-miR-4110靶基因的预测

利用生物信息学分析chi-miR-4110的靶基因，结果发现chi-miR-4110与 Smad2 mRNA 1 706～1 727 bp位点结合，初步确定 Smad2为chi-miR-4110的靶基因(图1)。

图1 chi-miR-4110与 Smad2 mRNA 1 706～1 727 bp位点结合Fig.1 chi-miR-4110 binds at 1 706-1 727 bp positions of Smad2 mRNA

2.2 Smad2-3′UTR的克隆和酶切鉴定

用15 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果如图2所示，目的条带单一、清晰，且长度与目的片段一致，初步判定该PCR产物为目的片段，将测序结果进行Blast对比，结果显示，该片段为 Smad2基因的3′UTR。将psiCHECK-2空载体和含有目的片段的重组载体同时进行酶切，分别可以得到大小不同的2个片段，其中重组载体的小片段为207 bp，与目的片段的大小相同(图3)。

1～4.PCR产物 PCR products;M.DNA marker Ⅰ

图2Smad2-3′UTR的PCR产物
Fig.2PCRproductsofSmad2-3′UTR

1.Check2 载体 Check2 vector; 2.重组载体 Recombination vector;M.DNA marker Ⅲ

图3酶切凝胶电泳图
Fig.3Electrophoresismapofenzymedigestionanalysis

2.3 双荧光素酶的活性

为验证chi-miR-4110是否能与 Smad2的3′UTR 区直接结合，试验组、对照组1和对照组2分别被转染到293T细胞，36 h后收集并裂解细胞，检测其荧光素酶活性。结果显示，与对照组1和2相比，试验组的荧光素酶活性显著降低(P<0.05，图4)。表明chi-miR-4110可与 Smad2-3′UTR作用位点相结合抑制其表达，从而导致荧光素酶的活性降低，由此可知， Smad2是chi-miR-4110的靶基因。

SNC. Smad2-3′UTR载体+阴性对照模拟物 Smad2-3′UTR vector + NC; SR. Smad2-3′UTR 载体 Smad2-3′UTR vector;SRM. Smad2-3′UTR+ chi-miR-4110模拟物 Smad2-3′UTR+chi-miR-4110 mimics; *.表示差异显著(P<0.05)，下同 * representsP<0.05，the same below

图4荧光素酶的相对活性
Fig.4Relativeactivityofluciferase

2.4 Smad2基因 mRNA及蛋白的表达量

将chi-miR-4410模拟物、NC和inhibitor、inhibitor NC转染到卵巢颗粒细胞中后，提取RNA及蛋白。以GAPDH为内参，通过实时定量PCR检测 Smad2 mRNA在奶山羊卵巢颗粒细胞中的相对表达量。qRT-PCR结果表明，转染chi-miR-4110后 Smad2 mRNA的表达量显著低于NC组(P<0.05，图5)；转染inhibitor 后mRNA表达水平上调，由此说明过表达chi-miR-4110使 Smad2 mRNA表达量降低。 Western blot检测Smad2蛋白的表达量，以GAPDH为内参做差异分析，结果发现转染chi-miR-4110后Smad2蛋白的表达量显著低于NC组(P<0.01，图6)；转染inhibitor后蛋白水平显著高于Inhibitor NC组 (P<0.05)，表明chi-miR-4110对Smad2蛋白的表达量起负调控作用。

3 讨 论

**表示差异极显著(P<0.01)，下同 ** representsP<0.01，the same as below.

图5Smad2mRNA的相对表达量
Fig.5RelativeexpressionofSmad2mRNA

A.蛋白免疫印迹杂交检测Smad2蛋白表达 Smad2 protein were detected by western blot; B.Smad2蛋白相对表达量 Relative expression of Smad2 protein

图6chi-miR-4110抑制Smad2蛋白表达
Fig.6chi-miR-4110inhibitsexpressionofSmad2protein

卵泡在生长过程中受到多种细胞内分泌或旁分泌因子的调节，其中大部分属于转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族。Smads家族成员是TGF-β超家族的细胞内信号介质，在颗粒细胞中阶段特异性表达，能够调控颗粒细胞的增殖、凋亡以及分化，同时对正常卵母细胞的生长发育、排卵和黄体化起关键调节作用[22]。Smad2在 Smads 家族中属于受体调节型蛋白，通常情况下， Smad2的表达与TGF-β密切相关，Smads直接被 TGF-β I型受体(TGF-βRI)磷酸化[23]。Smad2蛋白随着绵羊卵泡的发育，在卵泡的颗粒细胞持续表达，且腔前卵泡颗粒细胞中Smad2的表达量显著低于有腔卵泡的颗粒细胞[24]。研究发现，敲除雌鼠的 Smad2和 Smad3基因，小鼠会出现卵泡发育和排卵异常，生殖力显著下降[25]。徐梦思等[26]研究表明， Smad2基因在梅山猪M2卵泡(5.0～6.9 mm)中的表达量极显著高于杜洛克， Smad3和 Smad4在梅山猪 M1卵泡(1.0～3.0 mm)、 M2卵泡和L卵泡(7.0 mm)中的表达量分别显著和极显著高于杜洛克，揭示 TGF-β/Smad信号通路基因在卵泡发育及成熟的过程中发挥重要作用。 Smad4是不同 TGF-β信号通路配体信息传递的必需中心分子， 抑制 Smad4可促进猪卵泡颗粒细胞凋亡[27]， 敲除 Smad4 基因后小鼠在胚胎期就会出现死亡[28]。Yao等[29]研究发现 Smad4 是miR-224的靶基因，miR-224的过表达能够显著降低小鼠卵巢颗粒细胞中Smad4的蛋白水平，但对 Smad4 基因mRNA水平无显著影响，表明miR-224是通过抑制 Smad4翻译过程调控该基因的表达，此外，还揭示miR-224/Smad4 可以介导TGF-β调控小鼠雌二醇分泌以及腔前颗粒细胞的增殖。本研究的荧光素酶检测结果表明，chi-miR-4110通过与 Smad2-3′UTR相互作用导致荧光素酶活性降低，初步鉴定 Smad2为chi-miR-4110的靶基因。将chi-miR-4110 mimics和阴性对照分别转染到奶山羊卵巢颗粒细胞中，qRT-PCR和Western blotting结果表明，在奶山羊卵巢颗粒细胞中，过表达chi-miR-4110导致 Smad2 基因的mRNA以及Smad2蛋白的表达量均显著降低，表明chi-miR-4110通过降解 Smad2基因的mRNA和抑制其蛋白的翻译调控该基因的表达。

4 结 论

Smad2是chi-miR-4110的靶基因，在奶山羊卵巢颗粒细胞中chi-miR-4110靶向调控 Smad2的表达。揭示chi-miR-4110通过TGF-β/Smad信号通路调控卵泡的生长发育和排卵。

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