陇南核桃黑斑病病原菌拮抗菌筛选及鉴定

王 瀚 ，卓平清 ，王让军 ，叶文斌 ，王弋博 ，周 峰

（1.陇南师范高等专科学校 农林技术学院， 甘肃 陇南 742500；2.陇南特色农业生物资源研究开发中心， 甘肃 陇南 742500；3.天水师范学院 生物工程与技术学院， 甘肃 天水 741000；4.中国农业大学 农业与生物技术学院，北京 100193）

中国是核桃属Juglans植物的发源地[1]。近年来，核桃作为一种经济价值较大的林果树种受到人们的普遍关注。核桃黑斑病是一种严重的细菌性病害，其传播能力强、危害程度高，严重威胁核桃生产安全。该病常常造成叶片和果实的黑斑，造成落叶、落果，严重影响果农收入[2]。据报道该病病原菌为Xanthomonas arboricola pv,Juglandis[3]。但由于环境条件的改变，该病常会产生一些致病变种。本研究表明，核桃黑斑病病原菌Xanthomonas campestris pv. Campestris是引发甘肃陇南地区核桃黑斑病爆发的一种重要病原菌。

生物防治是一种绿色环保的有害生物防治方法。通过细菌间拮抗作用来防治一些重要的细菌病害越来越受到国内外研究者的重视[4-6]。早在1958年，张素雅就以放线菌作为拮抗菌来研究对其他菌株的拮抗作用[7]。几十年来，随着我国农业生物技术的发展，针对植物病原菌的拮抗细菌筛选的研究工作得到了极大发展，研究报道数量也急剧增加。目前，拮抗菌已在多数农作物及中药材病害防治方面成功应用，如黄芪[8]、辣椒[9]、黄瓜[10]、马铃薯[11]、苹果[12]、水稻等[13]。部分成果已转化为重要的生防农药，逐步得到推广应用。本研究以核桃黑斑病病原菌Xanthomonas campestrispv.Campestris为靶细菌，通过室内靶向多重筛选的方法，获得了具有较好拮抗作用的菌株并对其进行了分子鉴定，以期为后期开发生防农药奠定坚实的理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 供试土壤

从甘肃省陇南成县农业观光园核桃园区随机采集核桃树根际土壤，用自封袋装好后带回实验室，保存至4 ℃冰箱，用于拮抗菌的分离。

1.1.2 目标菌株

本实验从核桃病害部位分离到的是核桃黑斑病病原菌Xanthomonas campestrispv.Campestris。

1.1.3 供试培养基及试剂

筛选用培养基为常规LB培养基。Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒、dNTP、Sanprep柱式DNAJ胶回收试剂盒、细菌16S rDNA通用引物及Sanprep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒等试剂均购自上海生工有限公司；TaqDNA聚合酶购自MBI；pMD-18T克隆载体购自Takara。

1.2 方 法

1.2.1 菌株的分离与纯化

将10 g土样加入到90 mL无菌水中充分溶解，在28 ℃的摇床上振荡30 min，适当稀释后取土壤悬液0.1 mL涂布在固体LB平板上，于28 ℃培养48 h后，随机挑取单克隆，分别划线于平板上进行细菌纯化，之后挑取培养特征差异明显的菌落将其接种于LB斜面培养基上培养，待菌落长出后置于4 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 拮抗菌的筛选

采用改良对峙培养法进行拮抗菌的筛选（见图1）。首先在平板背部中心按照2 cm×2 cm划线形成正方形区域，在正方形区域内，用直径为5 mm无菌滤纸块蘸取病原菌Xanthomonas campestrispv.Campestris菌液，将其贴于正方形琼脂平板中心。正方形外围则均匀涂布土壤分离菌株。对照组（CK）则只在正方形琼脂平板中心粘贴含病原菌Xanthomonas campestrispv.Campestris菌液的滤纸片，之后将所有平板倒置于恒温培养箱，于28 ℃条件下培养7 d。待菌落长出后，测量相应菌落直径，统计处理数据。

图1 JK-2、JK-3、JK-12及JK-18菌株对核桃黑斑病病原菌的平板拮抗作用Fig.1 Plate antagonism of JK-2, JK-3, JK-12 and JK-18 strains against X. campestris pv. Campestris

抑制效果采用抑制率表示：抑制率=[(对照平板菌落直径－滤纸片直径)－(处理组平板菌落直径－滤纸片直径)]/(对照平板菌落直径－滤纸片直径)×100%。

1.2.3 拮抗菌的鉴定

形态学鉴定包括菌落形态、单个菌体形态、革兰氏染色及有无芽孢。16S rDNA分子鉴定：利用LB液体培养基，于30 ℃、150 r/min条件下振荡培养病原菌，16 h后收集细菌，细菌总DNA提取按照SK8255试剂盒所提供的提取方法进行。选用细菌通用引物（7F：AGTTTGATCMTGGCTCAG，1540R: GGTTACCTTGTTACGACTT），以细菌总DNA为模板进行PCR扩增。反应体系（25 μL）为：DNA 模板为 0.5 μL，10 × PCR Buffer 2.5 μL，dNTP为1μL，Taq 酶 0.2 μL，ddH2O 补加至 25 μL。扩增程序：94 ℃变性5 min；94 ℃ 43 sec；55 ℃42 sec；72 ℃2min，32 个循环；72 ℃延伸12min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，送至上海生工有限公司进行测序，测序结果在GenBank数据库中进行BLAST比对分析。

2 结果与分析

2.1 拮抗菌的分离和筛选

采用平板稀释法从土壤悬液中共分离出120株形态不同的菌株，经过初筛，共得到18株具有较好拮抗作用的菌株，分别编号为JK-1～JK-18（见表1）。经利用平板对峙法筛选，发现有5株对病原菌Xanthomonas campestrispv.Campestris的抑制率达到80%以上，分别是JK-2（94.30%）、JK-3（82.20%）、 JK-12（87.30%）、JK-14（88.10%）、JK-18（92.30%）。抑制率为70%～80%的共2株；60%～70%的6株；60%以下的有5株；抑制率最低的为JK-8（18.20%）。故本研究中重点选择抑制率在80%以上的菌株作为受试拮抗菌，并对其进行形态及分子鉴定。

2.2 5株拮抗能力较强拮抗菌的分子鉴定

将 JK-2、JK-3、JK-12、JK-14及 JK-18菌 株的PCR产物送上海生工进行测序，共获得上述菌株16S rDNA序列5条。经ClustalX1.8软件拼接后，与NCBI数据库中核苷酸序列进行BLAST分析，得到如下结果（见表2）。由表2可以看出，JK-2与JK-3、JK-12与JK-14均为同一菌株。

2.3 拮抗菌株JK-2与JK-18的鉴定

2.3.1 形态特征

菌株JK-2菌落呈淡黄色，显微镜下观察可发现部分菌体分裂形成不规则杆菌，在较老的培养物全部或大部分为球状细菌组成，为革兰氏阳性细菌（见图2A, D）。菌株JK-18菌落近圆形，边缘具有缺刻，中央隆起并向四周形成典型的放射褶，颜色呈乳白色（见图2B, C）。菌体呈杆状，为革兰氏阳性菌（见图2E），菌体大小为（1.2～3.4）μm×（0.3～0.5）μm，根据上述形态特点，将其确定为芽孢杆菌属Bacillus。

表1 拮抗菌的拮抗能力测定Table1 Antagonistic ability test of antagonistic bacteria

表2 拮抗能力较强细菌的鉴定结果Table2 Identification result of antagonistic bacteria with better antagonistic ability

2.3.2 16S rDNA序列系统发育学分析

图2 JK-2与JK-18的细菌形态Fig.2 Morphologies of JK-2 and JK-18 strains

琼脂糖凝胶电泳检测结果表明，拮抗菌JK-2（1 375 bp）与JK-18（1 405 bp）的16S rDNA条带清晰，亮度高，可以进行PCR扩增实验（见图3）。扩增完成经测序后获得16S rDNA序列，序列在GenBank数据库中进行BLAST，挑选同源序列分值较高的代表性菌株，采用邻接法（NJ）构建进化树（见图4）。系统进化表明，JK-2与JK-18菌株的16S rDNA序列分别 与Arthrobacter sp.（KF805083.1） 及Bacillus mojavensis（KF254575.1）的相似程度达99%，结合菌株的形态学等特征[14]，初步鉴定JK-2为节杆菌Arthrobacter sp.、JK-18为莫海威芽孢杆菌Bacillus mojavensis。

3 讨 论

近年来，利用拮抗细菌作为生物防治菌的研究报道较多，尤其在果树病害研究领域，应用生防菌实施绿色综合防治，是一个前景较为广阔的研究领域。井敏敏等[15]以芒果为实验材料，研究了不同浓度Burkholderia sp.的拮抗菌JS-8对芒果采后品质的影响，研究发现，经JS-8处理后芒果的果实色泽、果实硬度及可溶性物质的变化均有所改变，并且抑制了果实中相关酸类物质的下降，有效地延长了贮藏时间。有研究者[16]从瓜拉那Paullinia cupanavar.sorbilis幼苗中分离到102株内共生菌，研究表明，约15%的菌株对Colletotrichum gloeosporioides具有较好的抑制作用。殷晓慧等[17]以桃褐腐病为靶向菌，分离出了死谷芽孢杆菌Bacillus vallismortis和高地芽孢杆菌B. altitudinis2株拮抗细菌，结果表明这2种拮抗菌的使用可明显减缓桃树褐腐病的发病时间，极大地抑制了病原菌的扩散。

图3 拮抗菌JK-2、JK-18 PCR扩增产物的电泳结果检测Fig.3 Electrophoretic result of PCR amplif i cation products of the antagonistic bacterial strains of JK-2 and JK-18

图4 基于菌株JK-2、JK-18 的16S rDNA基因构建的系统发育树Fig.4 Phylogenetic trees of JK-2 and JK-18 strains based on 16S rDNA sequences

节杆菌Arthrobacter sp.是一种典型的土壤细菌，主要用于土壤修复与相关有害物质的降解[18-19]。未见用于植物病害拮抗细菌的相关报道。芽孢杆菌是目前广泛用于植物病害防治的拮抗细菌。常见的有枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌B. cereus、多粘芽孢杆菌B. polymyxa、巨大芽孢杆菌B. megaterium和短小芽孢杆菌B. pumilis等[20]。有关莫海威芽孢杆菌用于植物病害拮抗作用的研究报道较少，国内仅杨成德等[21]报道了从珠芽蓼中分离到的莫海威芽孢杆菌ZA1对马铃薯坏疽病菌具有拮抗作用。畅涛等[22]研究了莫海威芽孢杆菌ZA1对马铃薯的防病促生作用及对其防御酶的诱导作用。

核桃病害防治研究是经济林研究方面一个重要的研究领域，但是，多数传统的病害防治研究仅关注利用化学方法提高病害的防治率，并未考虑对环境造成的污染和破坏。近年来，关于核桃生物防治方面的研究逐渐增加，但主要集中在核桃根腐病及炭疽病的研究等方面[23-27]，对于核桃黑斑病的生物防治及拮抗菌的筛选，国内外尚无相关报道。在本研究中，利用平板对峙法筛选到几株拮抗效果较佳的细菌，其中JK-2节杆菌Arthrobacter sp.与JK-18莫海威芽孢杆菌Bacillus mojavensis拮抗作用最佳，极具开发潜力，但其抑菌机理及环境相容性等问题还需继续深入研究。

[1] 李好先,曹尚银,张 杰,等.大果型核桃新品种‘中核香’的选育[J]. 果树学报,2017,34(2):252-255.

[2] Romero-Suarez S, Jordan B, Heinemann JA. Isolation and characterization of bacteriophages infectingXanthomonas arboricolapvjuglandis, the causal agent of walnut blight disease [J].World J Microbiol Biotechnol, 2012, 28(5):1917-1927.

[3] Dye D W, Bradbury J F, Goto M,et al.International standards for naming pathovars of phytopathogenic bacteria and a list of pathovar names and pathotypes [J]. Review of Plant Pathology, 1980, 59: 153-168.

[4] 张晶晶,李建贵,郭艺鹏,等.新疆核桃腐烂病拮抗菌的筛选及鉴定[J]. 经济林研究,2016,34(1):71-75.

[5] Khabbaz S E, Abbasi P A. Isolation, characterization, and formulation of antagonistic bacteria for the management of seedlings damping-off and root rot disease of cucumber[J]. Can J Microbiol, 2014, 60(1):25-33.

[6] Hong CE, Jo SH, Jo IH,et al.Draft genome sequence of the endophytic bacteriumVariovorax paradoxusKB5,which has antagonistic activity against a phytopathogen,Pseudomonas syringaepv tomato DC3000.[J]. Genome Announc,2017,5(36):1-2.

[7] 张素雅.放线菌(Actinomyces sp.A)对一些病原细菌的拮抗作用的初步实验报告[J]. 微生物学报,1958,6(3):328-332.

[8] 任小霞,秦雪梅,王梦亮,等.山西黄芪根腐病优势病原菌鉴定及其拮抗菌的多重筛选[J]. 中药材,2016,39(10):2173-2177.

[9] 谈泰猛,黎继烈,申爱荣,等.辣椒疫病拮抗菌的分离、鉴定及其生防效果[J]. 生态学杂志,2017,36(4):988-994.

[10] 唐 蕊,张雪辉,殷世群,等.黄瓜枯萎病拮抗菌HM-7的鉴定[J]. 中国瓜菜,2016,29(8):13-16.

[11] Jun-Feng Shi, Chang-Qing Sun. Isolation, identification, and biocontrol of antagonistic bacterium against Botrytis cinerea after tomato harvest[J]. Brazilian Journal of Microbiology,2017,48(4):706-714.

[12] 袁 雪,王珊珊,赵晓萌,等.苹果腐烂病病原菌的鉴定及拮抗菌筛选[J]. 中国农学通报,2017,33(1):33-37.

[13] 李玉洋,辛寒晓,范学明,等.水稻恶苗病拮抗菌的筛选、鉴定及其抑菌活性[J]. 生物技术通报,2017,33(5):190-196.

[14] 马 放,杨基先,魏利等著.环境微生物图谱[M].北京: 中国环境科学出版社,2010:258-259.

[15] 井敏敏,田亚琴,邵远志. 拮抗菌JS-8对‘台农’芒果贮藏品质及保护酶活性的影响[J]. 食品与发酵工业,2017, 43(1):168-173.

[16] Maria Carolina Santos e Silva, Julio Cesar Polonio, Maria Carolina Quecine, et al. Endophytic cultivable bacterial community obtained from the Paullinia cupana seed in Amazonas and Bahia regions and its antagonistic effects against Colletotrichum gloeosporioides[J]. Microbial Pathogenesis,2016,98:16-22.

[17] 殷晓慧,王庆国,张 畅,等.桃果实褐腐病拮抗菌的筛选、鉴定及其拮抗活性[J]. 食品工业科技,2017,38(9):128-132,138.

[18] 褚娇艳,刘腾飞,张汉虞,等. 一株邻苯二甲酸二丁酯降解菌的筛选及其降解特性[J]. 微生物学通报, 2017, 44(7):1555-1562.

[19] 吴学玲,金德才,赵维良,等. 4株邻苯二甲酸二丁酯降解菌的分离鉴定及其相关降解基因的克隆[J]. 环境科学,2009,30(9): 2722-2727.

[20] 周晓梅,刘 强,王瑛璐. 拮抗菌生物防治农作物病害的研究进展[J]. 吉林师范大学学报(自然科学版),2010,31(4):36-39.

[21] 杨成德,畅 涛,薛 莉,等.珠芽蓼内生细菌ZA1的抑菌物质产生条件的优化及其稳定性测定[J]. 草业学报,2015,24(9):104-112.

[22] 畅 涛,杨成德,薛 莉,等.珠芽蓼内生菌ZA1对马铃薯的防病促生研究[J]. 草业学报,2015,24(12):83-91.

[23] 张晶晶,李建贵,郭艺鹏,等.新疆核桃腐烂病拮抗菌的筛选及鉴定[J]. 经济林研究,2016,34(1):71-75.

[24] 刘 洋,朱天辉,郑 磊,等.一株内生拮抗细菌的分离鉴定及其抗菌机理研究[J]. 植物保护,2016,42(1):33-39.

[25] 刘晓琳,肖俊文,王晓炜,等.核桃基腐病拮抗细菌的筛选与初步鉴定[J]. 天津农业科学,2015,21(7):93-96.

[26] 马 荣,王阳阳,刘晓琳,等.新疆核桃树腐烂病拮抗细菌的筛选及初步鉴定[J]. 新疆农业科学,2015,52(5):895-901.

[27] 段春华,刘幸红,牛赡光,等.一株拮抗细菌的鉴定及对植物炭疽病菌作用效果测定[J]. 江西农业学报,2014,26(3):94-97.