葡萄糖调节蛋白78在非酒精性脂肪性肝病发病中的作用*

王兰综述，杨云梅审校

非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）发病率逐年上升,已成为包括我国在内全球慢性肝病的首要原因，严重危害人民生命健康。非酒精性单纯性脂肪肝预后一般比较好，进展很慢，随访10～20年肝硬化发生率低（0.6%～3%）。而非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH)却可进一步发展、恶化成为终末期肝病，严重者可导致死亡[1]。目前NAFLD的发生发展机制至今仍尚不清楚，认为与氧化应激的增加、线粒体损伤、内质网应激和脂肪因子等因素相关[2，3]，但对导致进行性肝细胞损伤的机制有待于进一步探讨。肝细胞内含有丰富的内质网，是蛋白质合成与翻译后修饰，多肽链正确折叠与装配的重要场所。在一些病理生理情况下，如肥胖、营养过剩导致未折叠或错误折叠的蛋白大量蓄积在内质网（endoplasmic reticulum，ER）引发内质网应激，为了维持ER稳态，细胞激活未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）。UPR是一种保守性细胞自我保护性措施,通过促进内质网对蓄积在内质网腔内的错误折叠或未折叠蛋白质的处理,使细胞功能恢复正常并使之存活。但是过强或者持续时间过久的内质网应激可引起细胞凋亡[4]。内质网应激在NAFLD发病机制中的地位越来越受到重视[5]。

葡萄糖调节蛋白78（glucose regulated protein 78，GRP78）又名免疫球蛋白重链结合蛋白（the immunoglobulin heavy chain binding protein，Bip），与热休克蛋白70（Hsp70）家族具有高度同源性，是Hsp70家族的成员之一。GRP78主要分布在细胞内质网中，其生物学功能主要有：阻止内质网内新生肽聚集；参与UPR调控；启动内质网应激相关性细胞凋亡；参与内质网钙稳态的调节[6]。GRP78作为一个重要的内质网应激蛋白，其在NAFLD的发生发展中的作用也不容忽视,现综述如下。

1 GRP78的结构

GRP78定位于9号染色体长臂33区3带，由654个氨基酸组成，具有高度保守的 EEVD氨基酸序列，与热休克蛋白70（Hsp70）家族有高度同源性，是Hsp70家族的成员之一。 Hsp70的结构可分为：①44 kD部分（N端）。由4个α-螺旋形成 1个裂缝，裂缝底部带有 ATP结合位点，是结合ATP的结构域，有ATPase活性；②18kD部分。由4个反相平行的β-折叠和1个α-螺旋构成，是多肤的结合部位；③10 kD部分（C端）。主要由α-螺旋构成，是活性调节区域，具有高度保守的EEVD氨基酸序列[7]。

GRP78主要作为ER伴侣及内质网应激标志物存在于内质网，很多研究表明，当肿瘤细胞的葡萄糖代谢改变等内在因素改变，及或肿瘤细胞体外因素（如糖剥夺、缺氧、酸中毒）等微环境因素改变后，GRP78的表达明显增加，从而从内质网转移到细胞表面，作为细胞信号转导的受体发挥作用。同时，内质网应激也可以提高了GRP78基因1内含子保留，导致一种新的GRP78亚型表达的翻译（grp78va），由于新亚型缺乏ER信号肽而定位在细胞浆中，调节UPR信号起到细胞保护的作用。在有些小鼠中，GRP78也存在于线粒体中，调节细胞增值和凋亡[8]。因此，GRP78可以出现在内质网以外的部位，如线粒体，细胞核，移位到细胞表面，甚至能被特定的细胞系主动分泌[9]。

2 GRP78的生物学功能

2.1 分子伴侣功能，维持内质网稳定 在生理情况下，GRP78在真核生物内质网膜上通过与新生多肽以非共价键形式短暂地结合，随后松开，从而促进蛋白质的正确折叠和装配，并协助蛋白质跨内质网膜转运，降解错误折叠的蛋白质，维持内质网结构稳定。GRP78在应激反应调节时其基因的转录活性可提高10～25倍，表达量显著增高，从而维持了内质网钙稳态及内环境的稳定。饥饿的时候，GRP78通过ADP-核糖基化作用保存细胞内有限的营养。GRP78还能降低细胞对杀伤性T细胞的敏感性，阻止细胞凋亡。因此，近年来认为细胞受刺激时GRP78呈高表达并合成Bip/GRP78的反应，可能是细胞的一种重要的防御机制，该机制对细胞有保护作用，从而延长在各种不利因素刺激下的细胞生存期[10]。同时，GRP78还具有潜在的抑制细胞凋亡的作用，它主要通过抑制促凋亡分子BIK和caspase 7的活化从而发挥抗凋亡的作用。肿瘤细胞也存在GRP78的保护作用：GRP78可降低细胞毒性 T细胞对肿瘤细胞的杀伤力，促进肿瘤的生成和抗药性产生，防止肿瘤细胞凋亡。GRP78缺乏可导致内质网肿胀，无法形成自噬体，因此抑制了应激诱导的细胞自噬[11]。

2.2 肿瘤细胞信号转导的调节器 GRP78存在于肿瘤细胞的表面，可以作为肿瘤细胞的信号转导和生存能力的重要调节器，通过PI3K/Akt信号转导途径促进肿瘤细胞的增殖[12]。1997年GRP78被发现存在于恶性淋巴瘤的淋巴细胞和白血病细胞的表面。陆续也有报道，GRP78存在于NG 108-15（一种神经母细胞瘤与胶质细胞瘤杂交的细胞），肺腺癌（A549）、结肠癌（LoVo）、黑色素瘤细胞（Me6652/4）、骨肉瘤细胞（SJSA-1）和肝癌细胞（HepG2）和胃癌细胞（23132/87）等肿瘤细胞的表面，通过与其他蛋白在细胞表面形成复合体，调节肿瘤细胞的信号转导[13]。

2.3 调节内皮细胞的生存 GRP78在增值的内皮细胞和单核细胞的细胞表面表达，与这些细胞的的主要组织相容复合体（major histocompatibility complex，MHC）I形成复合体，调节内皮细胞的生存。由于肿瘤的进展通常需要肿瘤血管生成，从而保证肿瘤细胞的的营养和氧气供应，抗血管生成可以阻止肿瘤生长[14]。人纤溶酶原Kringle 5已被证明可以结合增殖的内皮细胞表面GRP78，形成重组Kringle 5（recombinant Kringle 5；rK5），增强 caspase-7 活性，诱导血管内皮细胞和肿瘤细胞的凋亡[15]。更有研究报道，GRP78存在于动脉粥样硬化斑块内皮表面，负调控组织因子介导的凝血级联启动[16]。

2.4 GRP78可以作为病毒进入宿主细胞受体 有研究报道，柯萨奇病毒进入宿主细胞需要主要组织相容性复合体I类分子。GRP78后来被证明作为共受体与MHC I类分子在细胞表面形成复合体有助于病毒内化[17]。GRP78表达于肝癌细胞表面，可以作为2型登革病毒进入肝癌细胞的受体，登革病毒也可直接作用于GRP78的N端和C端，从而影响病毒的传染性[18]。

2.5 分泌型的GRP8 在研究蛋白酶体抑制剂-硼替佐米抑制肿瘤血管形成的试验中发现，一些肿瘤细胞系可以分泌高滴度的GRP78在肿瘤的微环境中[19]。在胃癌的蛋白质组学研究中发现，与正常人群相比，胃癌患者血清中GRP78的阳性率为28%。重要的是，在胃癌和肝癌的患者血清中检测出GRP78自身抗体[20]。因此，分泌性GRP78能够调节多种病理和生理中的生物学过程。

2.6 细胞浆GRP78 GRP78被发现在细胞浆中，主要调节UPR的信号转导，病毒蛋白的组装，通过修饰UPR信号，从而影响肿瘤细胞的生存[21]。最近的一项研究表明，GRP78蛋白可能通过掩饰其C-末端KDEL信号存在于胞浆的装配室中[22]。

2.7 线粒体GRP78 最近研究发现，应激过程中，线粒体中的GRP78过表达可以保护星形胶质细胞的缺血损伤，降低了Ca2+从ER到线粒体，增加线粒体对Ca2+的吸收能力，减少自由基的产生，并保护呼吸链活性和线粒体膜电位稳定，提示GRP78可调节线粒体功能，如平衡能量消耗和维持线粒体稳态[23]。

2.8 细胞核GRP78 一个蛋白质组学的研究显示，用γ线照射哺乳动物细胞时发现细胞核中的GRP78与DNA相互交联，说明GRP78可以抵抗DNA损伤诱导的细胞凋亡[24]

3 GRP78在NAFLD发病中的作用

肝脏是维持机体稳态平衡的重要器官，参与机体糖代谢、糖原储存、氨基酸和核苷酸的合成、血浆蛋白和激素的生物合成和脂质代谢。肝脏甘油三酯的产生受多种机制的调节，包括体内脂肪的合成，脂肪酵解，饮食脂肪的摄入和脂蛋白颗粒的运输和分泌。氧应激、化学物质毒性、肝脏病毒感染、代谢紊乱，药物的滥用和酒精的过多摄入均可引起内质网应激，损伤内质网功能，脂肪稳态失衡，导致脂肪肝。目前有关GRP78在NAFLD的发生发展中的研究的报道逐年上升。有研究报道，特异性敲除肝脏Grp78基因导致轻度脂肪肝和肝脏的损伤，而且会加重酒精、高脂饮食、药物和毒素对肝脏的损伤，从而提示GRP78总的来说对肝脏起保护作用[25]。但同样，闵敏[26]等人观察了高脂饮食诱导大鼠NASH发病过程中内质网应激标志物GRP78的表达变化,结果表明，NASH组大鼠血清ALT、AST、FFA、TG和肝组织MDA水平均较对照组有不同程度的升高。肝组织GRP78基因和蛋白表达也随 NASH 加重而增强,16周时升高最为显著（P＜0.01）。因此，提示GRP78有可能通过启动内质网应激,导致脂质异常沉积,参与了NASH的发生发展。拜明军[27]等人探讨了油酸（不饱和脂肪酸）和软脂酸（饱和脂肪酸）对脂肪变性L02肝细胞凋亡和葡萄糖调节蛋白78（GRP78）表达的影响。结果显示不同性质的脂肪酸均可导致L02细胞发生以甘油三酯升高为特点的脂肪变性，均可引起不同程度的肝细胞凋亡，软脂酸组在48和72h的细胞凋亡率显著高于对照组、DMSO组以及油酸组，同时伴有GRP78蛋白及mRNA表达的明显增加。说明油酸不能影响GRP78的表达，饱和脂肪酸可能通过上调葡萄糖调节蛋白78的表达诱导脂肪变性肝细胞的凋亡。说明GRP78通过启动内质网应激诱导肝细胞的凋亡。Li et al[28]研究显示，大黄素对大鼠非酒精性脂肪肝有治疗作用，可以降低非酒精性脂肪肝大鼠的体重、肝指数、血清TG，其主要机制是大黄素通过抑制GRP78，降低内质网应激，通过ERS-SREBP1c通路在果糖诱导的非酒精性脂肪肝的过程中发挥重要的作用。林胜利[29]等人通过对成年大鼠持续腹腔注射CCL4，发现大鼠肝组织中有大量的脂肪空泡形成，同时MDA水平和GRP78蛋白表达显著升高，而牛磺酸和CCL4联合作用的大鼠肝组织中，甘油三酯和胆固醇含量较单纯用CCL4组明显降低，且肝组织中MDA和GRP78含量显著下降。结果表明，调节GRP78表达可抑制细胞内脂肪合成，CCL4刺激脂肪形成时GRP78升高也是一种内在的抗肝细胞脂肪堆积的保护机制。Wei et al在培养鼠H4IIE肝癌细胞时也发现，饱和脂肪酸（软脂酸）能诱导内质网应激GRP78表达，激活caspase系列；不饱和脂肪酸（油酸 ）则不能[30]。在吴逸园[31]等人的进一步实验研究中，通过RNAi特异沉默人肝癌HepG2内源性GRP78或过表达外源性GRP78，结果表明GRP78具有抑制生脂相关酶基因和SREBP-1转录因子的表达，降低HepG2细胞内的脂肪堆积的作用。

因此，我们可以推断，在非酒精性脂肪性肝病的不同疾病谱阶段，GRP78发挥着不同的作用。在单纯性脂肪肝阶段，GRP78表达升高，激活了未折叠蛋白反应，参与了内质网钙稳态的平衡，维持着内质网稳态，抑制肝细胞内的脂肪蓄积。在非酒精性脂肪肝性肝炎阶段，随着内质网应激的不断加强，GRP78表达升高，不足以抵抗内质网应激相关的细胞凋亡，随着肝脏炎症因子的不断释放，促使了NAFLD的进展。

近来研究表明，很少数NAFLD患者可进展为肝细胞性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）[32]。目前关于 NAFLD 导致HCC的确切机制尚不明确。但NASH-隐源性肝硬化-HCC的发病模式已被众多学者所认可[33，34]。White et al[35]回顾了一些纵向研究结果，探讨了HCC在NAFLD/NASH的流行情况，结果表明，随访了NAFLD患者21年，HCC的患病率为0%～3%，其中最早一例发生在NAFLD诊断后5.6年。而且HCC在NAFLD-肝硬化中的发生率为2.4%，平均随访时间为7.2年。一项日本的临床回顾性研究表明，既往大多数日本HCC的患者是在慢性丙型肝炎的基础上发生的。近来，由于抗病毒治疗和丙肝发病率的降低，非乙非丙型肝炎相关的HCC的发病率有所上升，有资料显示大约10%的NAFLD患者进展为NASH，3%NASH患者进展为肝细胞肝癌。NASH相关的HCC的高危因素包括进展性肝纤维化、高龄、遗传因素和饮食模式[36]。Arase et al随访了1600例≥60岁的NAFLD患者8.2年，NASH相关的HCC的发病率为0.63%[37]。因此，NASH相关HCC越来越受到研究者们的关注。然而，目前尚无简单、快速和特异性检测NAFLD/NASH相关HCC的肿瘤标志物。已有结果表明，Grp78f/f；Alb-Cre雄性小鼠随着年龄增长肝脏不会出现恶性病灶，而Grp78f/f;Alb-Cre雌性小鼠在长期酒精喂养后会出现DNA甲基化的改变和ERAD基因的表达，标志着肝脏出现肿瘤样包块。与单纯敲除肿瘤抑制因子PTEN基因相比，同时敲除肝脏GRP78和PTEN基因，小鼠会出现肝肿大，脂肪肝，肝损伤和肝细胞增殖，形成肝细胞肝癌和胆管细胞癌，说明GRP78促进肿瘤的生成[38]。我们知道，GRP78不仅维持内质网稳定，还可以存在肿瘤细胞表面，调节重要的信号转导促进肿瘤细胞的增值。因此，GRP78在NAFLD相关肝癌的发生中是否发挥重要的作用，目前尚未见文献报道，我们相信随着对GRP78蛋白的深入研究，将有助于探讨NASH相关HCC发病机制，为HCC的早期预防和早期发现提供理论依据。

4 GRP78的研究展望

近来研究表明，GRP78可以定位在细胞内的多个细胞器与细胞应对各种应激的适应性生存密切相关[39]。内质网应激是如何促进GRP78从内质网移位到细胞表面、细胞浆和线粒体的机制有哪些？细胞胞浆中的GRP78的相互作用伴侣有哪些？影响了哪些信号转导通路？GRP78在NAFLD/NASH相关HCC中是否及如何发挥作用？我们相信，随着对GRP78蛋白的更深入研究，有助于我们挖掘出NAFLD的新的发病机制，为NASH的早期阻断，预防NAFLD相关肝癌的发生提供理论依据。

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