枯草芽孢杆菌和绿色木霉对落叶及草坪碎屑腐解的影响

王楠+刘镔娴+徐伟宸+高立支+李松松+崔悦+王帅

摘要：落叶及草坪碎屑是园林生态系统中最常见的有机固体废弃物，通过腐解可转化成优质有机物料供园林绿化使用。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、绿色木霉（Trichoderma viride）是堆肥腐解常用的有益菌群，在促进腐殖化进程方面有着不同的效果。采用室内培养法，通过接种2类菌株悬液，揭示其在60 d培养期间对落叶及草坪碎屑混料腐解的动态差异。结果表明：绿色木霉在矿化混料总有机碳方面的能力要强于枯草芽孢杆菌；混料经绿色木霉腐解后，其P2O5含量可获得较大程度提升，相反，枯草芽孢杆菌对于混料N及K2O含量的促进作用更为明显；绿色木霉对于混料可提取腐殖酸碳含量（CHE）的利用程度较差，但对胡敏素碳含量（CHu）的矿化能力更强；2类微生物皆有利于混料腐殖质品质的提升，其中枯草芽孢杆菌的作用更为明显。本研究结果可为阐明落叶及草坪碎屑的腐解特征及筛选高效微生物菌群提供技术参考。

关键词：落叶；草坪碎屑；腐解；枯草芽孢杆菌；绿色木霉

中图分类号： S182文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）23-0258-04

毕延刚等指出，在堆肥进程接种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）可使堆料对枯萎病病原菌产生抑制作用[4]，此外，（Bacillus subtilis）也可加速物料的腐解进程，且对其中的生物毒性物質有降解作用[5]。李瑜等研究表明，由绿色木霉（Trichoderma viride）产生的纤维素酶活性较高，当其与枯草芽孢杆菌组成复合菌剂时，通过两者间比例的调整可有效缩短堆肥周期[6]。有学者利用微生物预处理手段，基于菌剂与混料基质间的不同比例（1 ∶19、1 ∶9、1 ∶4），将虫拟蜡菌（Ceriporiopsis subvermispora）接种于园林混料基质中，并在 30 d 培养时间内探讨混料木质素、纤维素、半纤维素及干物质的降解程度，并指出在此过程有甲烷气体产生[7-8]。Awasthi等研究了由黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）、绿色木霉（T. viride）、绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）所组成的混合菌剂在园林、农业及城市固体废弃物与木屑所组成混合物料中的堆肥效果，结果表明，在堆肥过程中，物料淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶及脱氢酶等活性均有所提升，且堆肥过程可缩减至4周以内[9]。可见，配伍适宜的混合微生物菌剂对堆肥品质的提升有所帮助。

Bacillus subtilis和Trichoderma viride对于堆肥过程具有较好的促进作用且功能不同。当前研究中，腐解物料多以农业废弃物及城市污泥为主，对于落叶及草坪碎屑等园林废弃物的堆腐研究尚缺乏系统性报道，而对于微生物菌剂的研究多集中于复合菌。本研究拟采用室内培养法，将落叶与草坪碎屑按照2 ∶8的质量比混合，通过Bacillus subtilis和Trichoderma viride接种，对其总有机碳、养分性状及腐殖质组成进行动态分析，并揭示2类微生物在园林废弃物腐解特征上的差异，旨在为园林固体废弃物的资源化利用及高效菌剂的筛选提供科学依据。

1材料与方法

1.1材料

落叶于2015年10月取自吉林农业科技学院校内园林绿地，所属区域以栽植银中杨、垂柳及玉簪等地被植物为主。将收集好的袋装落叶带回实验室，剔除多余枯枝、保留落叶，105 ℃ 下作杀青处理，再在55 ℃下烘干至恒质量，粉碎过 1 mm 筛。经测定，落叶粉末中的总有机碳（TOC）、全氮（N）、全磷（P2O5）及全钾（K2O）含量分别为58.3%、2.24%、1.00%、0.77%。

草坪碎屑于2015年9月取自吉林农业科技学院A座教学楼前草坪绿地，草种由狗牙根、早熟禾属及羊茅属组成。将经旋刀式剪草机剔除的碎草屑带回实验室，重复上述步骤，但不作粉碎处理，仅用剪刀将碎草屑继续剪碎至0.20～0.25 cm 小段，随后将其保存于玻璃干燥器中。经测定，草坪碎屑中TOC、N、P2O5、K2O含量分别为58.4%、2.68%、120%、2.09%。

绿色木霉（Trichoderma viride，Tv），水谷欣品牌，江苏省盐城市神微生物菌种科技有限公司，原粉粉剂，50亿活孢子/g；枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis，Bs），水谷欣品牌，江苏省盐城市神微生物菌种科技有限公司，粉剂，300亿/g。菌株悬液的制备方法：称取菌粉5.0 g置于100 mL离心管中，注入 100 mL 无菌水后以3 500 r/min的转速离心10 min，将固液分离，收集菌株悬液，无菌条件下保存，以防染杂菌。

1.2方法

将落叶粉末按照2 ∶8的质量比与草坪碎屑进行混合，称取20 g混料于100 mL锥形瓶中，随后用（NH4）2SO4溶液调节瓶装混料，使其C/N比为22.5 ∶1、含水量为50%，盖好自制防菌棉塞，高压蒸汽灭菌（121 ℃，20 min）、自然冷却后，分别接种5 mL绿色木霉或5 mL枯草芽孢杆菌悬液，随后用塑料薄膜封口，28 ℃条件下恒湿培养60 d，其间分别于0、15、30、60 d取样，每个处理重复3次。

采用H2SO4-H2O2消化、凯氏蒸馏法测定混料N含量，采用H2SO4-H2O2消化、钒钼黄比色法测定P2O5含量，采用H2SO4-H2O2消化、火焰光度法测定K2O含量，采用重铬酸钾氧化法测定TOC含量，具体过程参照NY 525—2012《有机肥料》农业行业标准。

采用腐殖质组成修改法对腐殖质各组分进行分离、测定。首先用70 ℃蒸馏水浸提混料中的水溶性有机碳（WSOC），随后用0.1 mol/L NaOH和0.1 mol/L Na4P2O7的混合碱溶液浸提可提取腐殖酸（HE），再用0.5 mol/L H2SO4从中分离胡敏酸（HA）和富里酸（FA），两者碳含量比值即为腐殖化系数。将提取HE后的沉淀物质用蒸馏水多次洗涤，直至洗出液近中性为止，将沉淀置于55 ℃鼓风干燥48 h，该残渣物质即为胡敏素（Hu）。HE、HA、FA、Hu组分的碳含量分别用CHE、CHA、CFA、CHu表示，均用重铬酸钾氧化法测定。endprint

采用T6新世纪紫外可见分光光度计（北京谱析通用有限公司）对HA碱溶液的吸光度（D400 nm、D465 nm、D600 nm、D665 nm）进行测定，并由此计算出光密度值（E4/E6）和色调系数（ΔlgK），具体计算方法如下：

E4/E6=D465 nm/D665 nm；（1）

ΔlgK=lgD400 nm-lgD600 nm。（2）

1.3数据分析

采用Excel 2003及SPSS 18.0软件对数据进行差异性分析。

2结果与分析

2.1绿色木霉和枯草芽孢杆菌对混料总有机碳含量的动态影响

由图1可见，绿色木霉（Tv）和枯草芽孢杆菌（Bs）接种后，前者使混料初始总有机碳（TOC）含量大于后者。培养期间，受Tv、Bs影响，混料TOC含量均呈先增加后下降的规律，培养结束后，TOC含量皆有所损失，Tv处理下的降低幅度更为明显，达到8.6%。上述规律表明，与枯草芽孢杆菌相比，绿色木霉菌株悬液中含有更多的有机碳成分，历经15 d培养，物料失重幅度大于TOC的矿化程度，因此，物料中TOC含量反而呈上升趋势，表现为浓缩效应，随着培养进行，有机碳矿化程度加剧直至培养结束，绿色木霉对于物料TOC的矿化程度要大于枯草芽孢杆菌。

2.2绿色木霉和枯草芽孢杆菌对混料全量养分的动态影响

由表1可見，接种Tv和Bs可对堆腐过程混料的全量养分产生较为显著的动态影响。Tv菌株悬液中含有比Bs更多的N和K2O，反之，Bs菌株悬液则含有更多的P2O5。随着培养的进行，混料N、P2O5、K2O含量均呈增加趋势。经过 60 d 培养，Tv和Bs处理下混料N含量的增幅分别为10.6%、32.0%，P2O5含量增幅为101.6%、15.1%，K2O含量增幅为39.6%、72.8%。由此可见，混料在培养过程中质量的缺失，即减重效应，会变相增加全量养分的含量，Tv菌株悬液中含有更多的N和K2O，而P2O5含量稍逊于Bs。培养结束后，绿色木霉对于混料P2O5含量的增加幅度较大，而后者归属细菌在培养过程中繁殖速率较快[10]，因此更有益于混料N和K2O的含量增加。

2.3绿色木霉和枯草芽孢杆菌对混料腐殖质组成的动态影响

如图2-A所示，尽管Tv和Bs的培养对于混料WSOC含量有所促进，但影响规律不同，具体来看，培养15 d期间，Tv对于混料WSOC组分的利用程度较高，使其含量有所降低，而后随Tv对腐殖质其他组分降解以及物料失重的影响，WSOC含量再度提高，增幅达42.3%。在添加Bs条件下，尽管Bs必然会对WSOC组分加以利用，但对于物料失重的影响更为显著，间接使得WSOC含量增加，历经60 d培养，最终该组分碳含量增加幅度达41.3%。由图2-B可知，无论接种Tv还是Bs，混料CHE均呈先增加后降低的变化规律，培养结束后，CHE均遭致损失，在Tv和Bs处理下，CHE的降低幅度分别达到8.6%和15.7%，可推断，微生物首先利用WSOC组分并展开对腐殖质组分的降解，加之混料失重，两过程均促使CHE增加，而后随着培养进行，部分CHE组分亦可被微生物降解，使其碳含量有所下降，在此过程，枯草芽孢杆菌的作用更为明显。图2-C描述了混料CHA变化，在此之前，笔者已经明确CHE（CHA+CFA）在培养结束后会有所下降的规律，而其中的CHA却被提升，可见，接种Tv和Bs均对落叶及草坪碎屑混料CHA的形成有促进作用。

培养条件下历经不同变化规律：Tv处理下该组分碳含量渐趋降低，Bs处理下该组分碳含量先增后减。培养结束后，混料CHu均遭受损失，可见，绿色木霉对于落叶及草坪碎屑混料中惰性腐殖质组分的降解能力要优于枯草芽孢杆菌。

2.4绿色木霉和枯草芽孢杆菌对混料腐殖化系数（CHA/CFA）的影响

如图3所示，无论接种Tv还是Bs，60 d培养结束后，混料CHA/CFA均有不同程度增加，从增加幅度来看，Bs处理有着更大优势，CHA/CFA增幅达到67.4%，而在Tv处理下的增幅仅为25.9%。上述规律表明，：绿色木霉和枯草芽孢杆菌在培养 60 d 内均可提高混料腐殖化系数，使得落叶及草坪碎屑混料富里酸向胡敏酸转化，尽管腐殖质活性有所减弱，但在此过程中腐殖质品质可获得提升，其中枯草芽孢杆菌的优势更为明显。

2.5绿色木霉和枯草芽孢杆菌对混料胡敏酸碱溶液光学性质（E4/E6、ΔlgK）的影响

由图4-A可知，接种Tv处理下，混料HA碱溶液的 E4/E6 经历了先增后减的变化，与其相反，接种Bs后，E4/E6先减后增，总体看来，2个处理均可促使E4/E6增加，相较而言，Tv对其促进作用更为明显，增幅达20.9%。由图4-B可知，在Bs处理下ΔlgK的变化规律与E4/E6相同，而Tv处理下的ΔlgK则历经渐趋增高的趋势，培养结束后， 2个处理下

ΔlgK值均有所增加。

一般来讲，HA碱溶液的E4/E6和ΔlgK越高，表明其数均分子量越小，分子结构越简单，反之，则其腐殖质分子量越高，缩合度和芳构化程度愈高[11]。依据该原理可作推断，Tv和Bs均有助于混料HA分子的简单化，其中Tv的优势更为明显。

3结论与讨论

绿色木霉为半知菌类，产孢量大、环境适应性强，其在生长过程不断向胞外分泌蛋白酶类物质，该酶活性的强弱反映了菌丝体生长过程中对外界复杂有机物的分解能力[12]，此外还能产生3种纤维素酶且均为胞外酶， 对纤维素的降解能力

更强[13]。因此，在本试验条件下，绿色木霉在充分供应氮素情况下，在矿化混料TOC方面的能力要比枯草芽孢杆菌更有优势。接种绿色木霉后混料的TOC含量大于同条件下接种枯草芽孢杆菌的处理结果，这表明前者菌株悬液中含有更多的微生物量碳，使得起始TOC含量略大。接种2类菌株悬液后，混料TOC含量的变化趋势相似，均表现为先升高后降低的规律，最终TOC含量均有不同程度损失，这与徐庆贤等的研究结论[14]有相似之处。经过2类菌株的培养，15 d后混料失重程度大于TOC的矿化程度，因浓缩效应的产生使TOC含量有所增高。随着培养时间延长，TOC矿化程度加剧，比照培养前后混料TOC的差异可知，绿色木霉对混料的矿化、分解能力要大于枯草芽孢杆菌。endprint

混料经绿色木霉腐解后，其P2O5含量有所增加，而枯草芽孢杆菌对混料N及K2O含量的促进作用更为明显。接种后，菌株在新培养环境下消耗营养物质来完成生命活动，致使物料失重，当失重速率超过养分降低速率时会出现营养物质浓缩的现象，最终使其含量增加[7-8]。绿色木霉悬液中含有更多N和K2O，对P2O5的利用程度相对较弱，因此，失重后更有利于P2O5含量的增加，同理，枯草芽孢杆菌含有更多P2O5，在繁殖過程对N和K2O的利用程度较弱，最终使物料中2种养分得以浓缩[15]。

绿色木霉对于混料CHE的利用程度较差，仅为 8.6%，但其对CHu的降解能力更强。在2类菌株培养条件下，混料CHE先略有增加而后大幅度降低，相比之下，枯草芽孢杆菌对于堆料CHE的利用程度更强，但对于CHu的降解效果并不明显，这与朱伟宁等研究结论[16]相似。

胡敏酸和富里酸是腐殖酸的两大核心组分，两者皆为生物学稳定性物质[17]，两者之比即腐殖化系数，在很大程度上决定了腐殖质的品质[18]。经过60 d培养，混料胡敏酸有向富里酸缩合的趋势，在此过程中，枯草芽孢杆菌接种培养下CHA/CFA增加了67.4%，而绿色木霉培养下的CHA/CFA增加幅度仅为25.9%。可见，2类菌株皆有助于落叶及草坪碎屑混料腐殖质品质的改善，其中枯草芽孢杆菌的作用效果更佳。

从HA碱溶液E4/E6和ΔlgK的变化趋势可知，2类菌株均有助于混料HA分子的简单化，通过对HA组分实施降解而使其芳构化程度减弱、脂族碳含量增加，在此过程中，绿色木霉的优势更大，这与赵恺凝等的报道结果[15]一致。受到枯草芽孢杆菌影响，混料HA分子结构先复杂而后渐变简单，在此过程中，混料WSOC含量、CHE、CHA、CHu均有所增加，综合考虑是因为物料失重、水浮物（用水浸提WSOC组分时被滤纸阻隔在外的、尚未完全降解的植株残体）降解导致HA分子复杂化，而后随WSOC缩合以及HA降解，最终使该分子结构向简单化方向发展。而在绿色木霉影响下，混料WSOC组分可发生部分缩合[19]，加之对HA的矿化，尽管对Hu组分也有所降解，但所得有机分子片段并没有扭转HA分子向简单化方向发展的趋势。

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