沉默MagT1影响大鼠心肌细胞内Mg2+水平和细胞凋亡的研究*

滕飞翔，沈之君，赵洪侠，张栋梁，杨留才△

(1.江苏医药职业学院基础医学部，江苏盐城 224005；2.南通大学医学院病理学与病理生理学系，江苏南通 226001；3.潍坊护理职业学院医学基础部，山东潍坊 261041)

镁离子(Mg2+)是一种对心肌细胞生命活动有重要影响的二价阳离子，其具有舒缓血管平滑肌、改善缺血心肌的能量代谢、纠正缺血心肌的不应期等作用[1]。当Mg2+代谢失衡时，会导致患者出现心力衰竭、心房颤动、心律不齐、冠状动脉粥样硬化性心脏病等症状[2-6]。有研究表明，Mg2+进出细胞会通过离子通道或转运体等来实现，目前已经发现了多种跨细胞膜转运Mg2+的通道或转运体，普遍存在于哺乳动物的各组织和器官内[7-11]。

镁离子转运蛋白1(magnesium transporter 1，MagT1)存在于哺乳动物的多种细胞内，含有335个氨基酸[12]。GOYTAIN等[12]研究显示MagT1是一种特异性的Mg2+转运体。ZHOU等[13]实验表明MagT1在维持细胞内外Mg2+稳态中起非常重要作用。还有研究表明，MagT1通过调节Mg2+的转运，影响多种组织和器官，对骨细胞分化、骨整合、癌细胞诊断、妊娠胎盘和胚胎发育起到重要作用，还会导致XMEN综合征、免疫缺陷相关疾病等[14-22]。

目前MagT1的相关研究较少，本研究应用 RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术，体外合成siRNA并转染大鼠心肌细胞，沉默心肌细胞内的MagT1，观察其对胞内Mg2+浓度和心肌细胞生存及正常生命活动的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1实验动物 1 d龄SD大鼠(南京青龙山动物养殖场和南通大学医学院实验动物中心提供)10只，雌雄不限。

1.2试剂 DMEM培养基购自日本Nissui pharmaceutical公司，胎牛血清购自美国Hycolone公司；siRNA序列购自上海吉玛公司；Trypsine、Trizol、LipofectamineTMRNAiMAX、荧光二抗购自美国Invitrogen公司；Ⅱ型胶原酶购自美国GIB- CO公司；Taq DNA 聚合酶、反转录试剂盒购自日本TaKaRa公司；MagT1兔抗购自北京奥维亚公司；α-actin鼠抗购自美国Abcam公司；异硫氰酸荧光素标记的膜联蛋白V(Annexin V-FITC)0凋亡试剂盒购自美国Biouniquer公司。

1.3仪器 PCR 扩增仪(美国 Bio-Rad公司)；凝胶成像系统(上海培清科技有限公司)；稳压稳流电泳仪(北京市六一仪器厂，型号 DYY-Ⅲ2 型)；DYCp-31D 型水平电泳槽(北京市六一仪器厂)；高速低温离心机(德国 Eppendorf公司)；常温离心机(德国 Eppendorf公司)；隔水式恒温培养箱(上海一恒科技有限公司，型号GHP-9080)；微量移液器(德国 Gilson公司)；pH计(上海雷磁)；正置荧光显微镜(日本OLYMPUS公司，型号BX51)；细胞培养箱(美国 Thermo公司)；流式细胞仪(美国贝克曼库尔特公司)。

1.4方法

1.4.1大鼠心肌细胞原代培养 10只1 d龄的普通级SD大鼠，无菌条件下剪取心脏，使用D-Hanks液漂洗3次。在小培养皿中剪下心尖(心室肌)部分，把心尖部分剪碎至1～2 mm3碎块。将碎块置于小瓶中加入0.08%胰酶+Ⅱ型胶原酶混合液，置于37℃水浴恒温振荡仪中反应10 min，弃去上清液；沉淀部分重复上述步骤，反应后反复吹打沉淀，把浑浊的液体吸出置于离心管中，加含15%血清的DMEM培养液终止胰酶消化，以1 000 r/min的速度离心10 min，弃去上层液体后加入含15%血清的DMEM培养液重悬沉淀中的细胞，放于培养瓶中置于37 ℃、5% CO2培养箱中1.5 h，进行差速贴壁[23]。 随后以105/mL的密度种于6孔板中，24 h后更换培养基，加0.01 mmol/L的5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)[24]抑制成纤维细胞的生长。将细胞悬液与1%的台盼蓝溶液1∶1混合进行存活度计数，被染色的代表死细胞。培养的大鼠心肌细胞中常混有成纤维细胞，本研究选择一种心肌细胞具有但成纤维细胞没有的α-actin蛋白一抗[25]进行免疫荧光反应，以鉴定心肌细胞的纯度。

1.4.2siRNA转染心肌细胞 本研究委托上海吉玛公司设计生产4对MagT1 siRNA和1对阴性对照siRNA，本课题组前期的研究[26]筛选出沉默效果最好的1对siRNA(序列为5′-GAU UGG ACU UGU UGU GUU ATT-3′，5′-UAA CAC AAC AAG UCC AAU CTT-3′)，阴性对照siRNA序列为5′-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3′，5′-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT -3′。本研究设空白对照组、阴性siRNA组、siRNA组。使用LipofectamineTM RNAiMAX试剂，按照说明书要求将siRNA转染进大鼠心肌细胞。

1.4.3反转录PCR方法检测MagT1 mRNA表达 Trizol法提取大鼠心肌组织总RNA，使用2%琼脂糖凝胶电泳检验总RNA条带的完整性。使用紫外分光光度计检测总RNAOD260/280吸光度比值(比值大于1.8为合格)，并计算总RNA浓度。按照反转录PCR试剂盒操作说明书进行反转录和PCR反应，以人β-actin为内参，MagT1引物序列为5′-GAA GCA GCC AAG CAC AGT TTG TAG-3′，5′-CAA TAT CCA TGT CAG AGG CAG CA-3′ ；β-actin引物序列为5′-GGA GAT TAC TGC CCT GGC TC CTA-3′，5′-GAC TCA TCG TAC TCC TGC TTG CTG-3′。扩增条件为95 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共计30个循环；72 ℃延伸10 min，最后使用琼脂糖凝胶电泳检验结果。本研究使用反转录PCR方法检测0 d(刚出生)、21 d(哺乳期结束)和63 d(性成熟)3个不同发育时期的大鼠心肌细胞中MagT1的mRNA表达水平，使用反转录RCR方法对siRNA转染48和60 h的大鼠心肌细胞MagT1 mRNA沉默效率进行检测。

1.4.4Western blot方法检测MagT1蛋白质表达 使用1 mL组织裂解液作用于100 mg大鼠心肌组织，取得总蛋白质，考马斯亮蓝法检测蛋白质浓度。按5∶1比例混入6倍浓度的上样缓冲液，煮沸5 min使蛋白质变性，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(5%浓缩胶，电压80 V，时间1 h；12%分离胶，电压120 V，直至电泳结束)。蛋白质分离后，使用180 mA转膜2 h，将蛋白质转至 PVDF膜上。膜置于Western封闭液(3% BSA TBST中)中处理1 h，然后置于纯化的一抗稀释液(1∶1 000)中室温孵育2 h或4 ℃过夜。TBST清洗后，将膜置于二抗稀释液(1∶3 000)中，室温孵育1 h。使用X光片取得印迹结果，并采用Quantity One 扫描软件分析相对灰度值。本研究使用Western blot方法对siRNA转染48和60 h的大鼠心肌细胞MagT1蛋白质沉默效率进行检测。

1.4.5Mag-indo-1检测心肌细胞内Mg2+浓度变化 Mag-indo-1是一种特异性的Mg2+荧光探针，可以检测细胞内Mg2+浓度变化。6孔板中用盖玻片进行心肌细胞爬片，24 h后转染MagT1 siRNA，过48 h或60 h向含盖玻片孔中加入Mag-indo-1和D-Hanks混合液，然后放于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育1 h。将盖玻片倒置放于滴好甘油的载玻片上，在荧光显微镜下拍照，最后使用Image J软件对细胞荧光照片进行半定量分析。本研究使用Mag-indo-1免疫荧光方法对siRNA转染48和60 h后的大鼠心肌细胞Mg2+浓度进行检测。

1.4.6流式细胞仪检测细胞凋亡 使用AnnexinⅤ-FITC/PI试剂盒对各实验组细胞进行染色，使用流式细胞仪对细胞的凋亡情况进行检测。贴壁心肌细胞用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶收集；用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞2次(2 000 r/min离心5 min)收集(1～5)×105个细胞；加入500 μL的Annexin Ⅴ Binding Buffer悬浮细胞；加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC混匀后，加入5 μL Propidium Iodide，混匀避光、室温反应10 min；用流式细胞仪检测(Ex=488 nm；Em=530 nm)细胞凋亡情况。本研究使用流式细胞法对siRNA转染48和60 h后的大鼠心肌细胞细胞凋亡率进行检测。

2 结 果

A：大鼠心肌细胞;B：大鼠心肌细胞α-actin蛋白质免疫荧光;C：大鼠心肌细胞DAPI免疫荧光

图1大鼠心肌细胞免疫荧光图

2.1大鼠心肌细胞存活度、形态和纯度检测 点数400个细胞进行台盼蓝染色，染色细胞数量为31个，细胞存活率为92.25%(369/400)。细胞未贴壁时呈圆形。2 h后细胞开始贴壁，初期呈梭形，之后进行舒展。24 h后全部贴壁，呈梭形、菱形或多角形，大部分进行搏动。72 h后形成细胞簇，搏动同步化，每分钟65～85次。心肌细胞纯度免疫反应结果显示，心肌细胞呈绿色荧光，成纤维细胞无荧光，见图1。在荧光显微镜下点数染色的细胞，计算纯度。选取了10个不同视野，每个视野点数200个细胞。而2 000个细胞中被染色的细胞有1 932个，即心肌细胞纯度为96.60%(1 932/2 000)。

2.2不同时期大鼠心肌细胞MagT1 mRNA表达情况 0、21和63 d大鼠心肌细胞中MagT1 mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)，见图2。

2.3siRNA沉默大鼠心肌细胞MagT1并检测沉默效率 siRNA转染心肌细胞48 h后，MagT1 mRNA的沉默效率为51.83%，MagT1蛋白质的沉默效率为56.75%。转染60 h后，MagT1 mRNA的沉默效率为86.91%，MagT1蛋白质的沉默效率为83.85%，差异均有统计学意义(P<0.05),见图3。

2.4大鼠心肌细胞MagT1沉默后细胞内Mg2+浓度检测 siRNA转染大鼠心肌细胞48和60 h后，胞内Mg2+浓度分别降低29.13%和41.32%，差异均有统计学意义(P<0.05),见图4。

A：大鼠心肌细胞MagT1 mRNA 的反转录PCR分析;B：大鼠心肌细胞MagT1 mRNA 表达

图2 0、21、63 d大鼠心肌细胞MagT1 mRNA的表达情况

A：转染48 h；B：转染60 h；1：MagT1 mRNA沉默情况；2：MagT1蛋白质沉默情况；a:P<0.05；b:P<0.01

图3 siRNA转染心肌细胞48和60 h后的MagT1 mRNA和蛋白质沉默效率

2.5大鼠心肌细胞MagT1沉默后细胞凋亡检测 siRNA转染大鼠心肌细胞48 h后，空白对照组和阴性siRNA组的细胞凋亡率分别是2.86%和3.09%，差异无统计学意义(P>0.05)；而siRNA组的细胞凋亡率(31.18%)比阴性siRNA组显著增高，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图5。siRNA组细胞的密度和体积小于空白对照组和阴性siRNA组，折光性降低，伪足变细，搏动节律降为每分钟30～50次，见图6。

siRNA转染大鼠心肌细胞60 h后，空白对照组和阴性siRNA组的细胞凋亡率分别是5.77%和5.48%，差异无统计学意义(P>0.05)；而siRNA组的细胞凋亡率(40.61%)比阴性siRNA组显著增高，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图5。另外siRNA组细胞的密度和体积更小，结构更紧密，搏动节律降为每分钟20～30次，见图6。

a:P<0.05,b:P<0.01

图4 siRNA转染心肌细胞48和60 h后细胞内Mg2+浓度变化

a:P<0.05；b:P<0.01

图5 siRNA转染大鼠心肌细胞48和60 h后的凋亡检测图

图6 siRNA转染大鼠心肌细胞48和60 h后的细胞形态图

3 讨 论

与其他原代大鼠心肌细胞培养方法[27-28]相比，从新生乳大鼠、清洗液种类、胰酶浓度、胶原酶配比组成、胎牛血清浓度和细胞混液离心时间等方面进行轻微改良，得到了存活率和纯度高、生命活动强的细胞。在不同发育时期的大鼠心肌细胞中，MagT1表达水平差异无统计学意义(P>0.05)，说明MagT1有可能在心肌细胞起着稳定而重要作用。

本研究设计并合成了MagT1 siRNA后，先经过预实验，选出沉默效果最好的1对siRNA[25]。根据siRNA说明书和其他研究情况，选取了转染48和60 h两个时间点进行MagT1的沉默情况检测，发现转染48 h后心肌细胞MagT1蛋白质被沉默了56.75%，而60 h后MagT1蛋白质被沉默了83.85%，达到了预定的目标，为后续的实验进行奠定了基础。

ZHOU等[13]使用siRNA显著降低HEK-293T细胞中MagT1表达水平，当胞外具有相同的Mg2+浓度(10 mmol/L)时，MagT1 siRNA处理过的细胞中游离Mg2+浓度会比阴性siRNA对照组减少50%～60%。本研究与ZHOU等[13]结果相似，发现显著沉默MagT1后，大鼠心肌细胞内的Mg2+浓度显著降低。TASHIRO等[29]使用缺镁食物喂养大鼠4～6周后，与对照组相比，缺镁大鼠血清Mg2+总浓度显著降低，心室肌细胞膜上包括MagT1在内的5种Mg2+通道或转运体表达都有所上调，使心室肌细胞内Mg2+浓度无显著降低。本课题组与TASHIRO等[29]研究结果共同说明MagT1在维持心肌细胞内Mg2+稳态起着重要作用。

以斑马鱼为实验动物的研究中，MagT1蛋白质表达显著下降，会影响胚胎细胞的正常功能及生存[13]。与ZHOU等[13]结果相似，本研究发现大鼠心肌细胞中的MagT1被显著沉默后，细胞凋亡率显著升高，细胞形态和搏动也出现了异常，说明MagT1对心肌细胞的生存与正常生命活动产生了很大影响。推测这种现象可能是由于MagT1被显著下调，导致大鼠心肌细胞内的Mg2+浓度显著降低，从而导致细胞的生存与正常生命活动被影响，这有待于进一步研究。

综上所述，siRNA有效沉默大鼠心肌细胞MagT1，使细胞内Mg2+浓度显著下降、细胞凋亡率显著上升，对细胞生存和正常生命活动有较大影响为今后探索心肌细胞内Mg2+浓度变化与凋亡的关系和MagT1沉默诱导的心肌凋亡机制奠定了实验基础。

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