基因甲基化修饰对宫颈癌病变影响的研究进展

张睿怡 综述 耿 力 审校

北京大学第三医院妇产科(100191)

宫颈癌是女性最常见的妇科恶性肿瘤之一，是发展中国家第二常见肿瘤，仅次于乳腺癌。2012年全球宫颈癌新发病例52万余例，死亡病例27万余例，其中发展中国家死亡病例约占90%。宫颈癌筛查可以显著降低宫颈癌的死亡率[1]。现已知人乳头瘤病毒(HPV)感染是发生宫颈癌的主要原因，超过90%的宫颈鳞癌患者可检测到HPV阳性。但在HPV感染的妇女中只有少数发展为宫颈癌，因此，寻找有效宫颈癌筛查方法以及宫颈癌发生发展中的分子生物学指标显得尤为重要。

1 DNA甲基化

随着肿瘤发病机制研究的进展，学者们认识到表观遗传学等DNA序列以外的基因调控机制异常在肿瘤的发生发展中起着重要作用。其中，DNA甲基化是最早发现的表观遗传学的表现形式之一，是调节基因功能的重要机制，也是目前表观遗传学研究的热点领域，它参与维持正常细胞功能、遗传印记、基因沉默等，与肿瘤发生密切相关。DNA甲基化是表观遗传学主要修饰方式，在不改变DNA一级结构的情况下，可使某些基因失活或转录遏制，而去甲基化可诱导基因活化或再表达，从而在维持基因组稳定性方面发挥着重要作用。其主要机制是在DNA甲基化转移酶(DNMT)的催化作用下，使胞嘧啶磷酸鸟嘌呤二核苷酸(CpG)5’端C原子与S-腺苷甲硫氨酸(SAM)提供的活性甲基发生共价结合，形成DNA的甲基化修饰。甲基化的胞嘧啶并不影响基因序列，但使基因表达受到一定影响，是转录抑制的主要机制[2]。人体中CpG有两种存在方式，一种是散在分布的CpG，以甲基化形式存在，成为CpG位点；另一种为富含CG的DNA短序列，称为CpG岛，在正常人体细胞中处于非甲基化状态，通常位于基因启动序列和基因编码序列中。而在肿瘤组织中，可发现一些抑癌基因DNA超甲基化或原癌基因低甲基化，直接导致抑癌基因失活或表达沉默，癌基因诱导激活或重新表达，从而诱导癌变发生[3]。因此，DNA异常甲基化对于肿瘤的早期发现有着重要意义，可能成为肿瘤筛查的有效分子标志。

2 抑癌基因DNA甲基化与宫颈癌

2.1 DAPK1基因甲基化

死亡相关蛋白激酶1(DAPK1)是γ干扰素介导的凋亡正性调节因子，DAPK1编码160kD的钙调蛋白相关丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是一种与多种细胞死亡相关信号通路相联系的抑癌基因[4]。赵先兰等[5]对132例宫颈病变样本进行检测，其中宫颈癌52例、宫颈上皮内瘤变(CIN)60例、正常宫颈鳞状上皮20例，发现DAPK1基因甲基化比率在正常组织、CIN和宫颈癌组织中分别为0%、18.3%、65.4%，其甲基化程度与病变程度呈正相关，而DAPK蛋白表达与病变程度呈负相关，提示DAPK启动子基因甲基化与DAPK基因沉默相关，并且可能参与宫颈癌的发生。Lattario等[6]对HPV和EB病毒感染的宫颈鳞状上皮内瘤变中的DAPK甲基化异常进行分析，其结果显示DAPK甲基化异常与病毒感染无关，同样认为DAPK基因启动子异常甲基化可能参与宫颈癌病变的发展，并可能成为判断宫颈癌病变的生物学指标。Sun等[7]对250例宫颈病变组织3个基因进行了甲基化分析，同时利用ROC曲线评估各基因区分高级别宫颈病变时的作用，结果提示，联合MGMT和DAPK1基因甲基化检测可增加高级别宫颈病变筛查效率。

2.2 Ras相关区域家族1A基因甲基化

Ras相关区域家族1A(RASSF1A)被认为是一种抑癌基因，参与多种肿瘤的发生发展，其编码蛋白类似Ras效应蛋白，参与调节多种细胞凋亡及细胞周期检测点途径[8]。RASSF1A启动子CpG岛异常甲基化改变使该基因沉默，从而导致RASSF1A功能减弱或缺失，这种表观遗传机制也被认为是肿瘤发生机制之一[8-9]。目前研究发现，RASSF1A高频率的甲基化异常在多种恶性肿瘤中均有发生，其中包括乳腺癌、肺癌、消化系统肿瘤、膀胱癌、前列腺癌等，但其导致肿瘤发生的具体机制尚不明确，可能与RASSF1A基因沉默，从而影响细胞周期进展、抑制促调亡等作用[9]。Pan等[10]检测65例宫颈鳞癌样本和40例正常宫颈组织样本RASSF1A基因启动子甲基化情况，其甲基化率分别为20%和0%。Cohen等[11]研究发现，宫颈腺癌RASSF1A基因甲基化程度(45%)高于宫颈鳞癌(0%)。Kang等[12]的研究也报道了相似结果。由于宫颈鳞癌中RASSF1A基因甲基化程度在各研究中表现不同，而在宫颈腺癌中呈现高频率甲基化，因此，RASSF1A基因异常甲基化可能作为判断宫颈腺癌发生的分子标志。

2.3 细胞黏附分子1基因甲基化

细胞黏附分子1(CADM1)又称为肺癌肿瘤抑制因子1(TSLC1)，主要发挥维持细胞间粘附稳定以及细胞骨架构建的功能。该基因位于染色体11q23.2中，作为一种抑癌基因，其转录沉默导致其蛋白表达下降与肺癌、肝细胞癌等多种肿瘤发生有关[13]。Overmeer等[14]研究发现，CADM1基因甲基化频率与宫颈病变程度成正相关，在正常宫颈组织中为5%，CINⅢ样本中为30%，宫颈鳞癌组织样本为83%，但CADM1蛋白表达却随宫颈病变程度增加而降低，表明CADM1基因启动子甲基化导致其基因沉默，同时CADM1基因异常甲基化可能与宫颈癌发生有密切联系。有研究发现，CADM1与MAL基因甲基化异常提高了高级别宫颈病变的检出率，提示存在CIN治疗后再发高级别病变的风险[15-16]。研究表明感染高危型HPV妇女联合应用CADM1和MAL基因甲基化检测可以作为宫颈癌筛查的另一种方法。

2.4 配对盒家族基因1基因甲基化

配对盒家族基因1(PAX1)是转录因子配对盒家族成员之一，该基因在胚胎形成和脊柱发育过程中起重要作用，同时在卵巢癌和宫颈癌中，PAX1因甲基化修饰沉默，提示其可能是一种抑癌基因。2008年，Lai等[17]首先发现宫颈癌中PAX1甲基化，宫颈鳞癌组织PAX1基因甲基化异常频率为94.4%，而正常宫颈细胞为0%。该研究同时指出，单独应用PAX1基因甲基化检测作为筛查指标，其特异性为99%，联合应用HPV检测和PAX1基因甲基化检测临床筛查敏感性从66%提高为80%。因此，PAX1基因甲基化检测在宫颈癌早期筛查中具有重要意义。随后，Huang等[18]检测宫颈癌旁组织和远隔组织PAX1基因甲基化程度，其中82%癌旁正常组织存在PAX1基因的甲基化，只有40%远隔组织发生甲基化，说明PAX1基因甲基化可能随病变部位存在区域分布。Nikolaidis等[19]对将PAX1最为筛查指标的数据进行meta分析，诊断CINⅡ以上病变时其敏感性与特异性分别为0.66和0.92，而诊断CINⅢ以上病变时其敏感性与特异性分别为0.77和0.92。该分析提示，PAX1甲基化检测可能成为提高筛查宫颈病变特异性的有效方法。

3 HPV DNA甲基化与宫颈癌

HPV一种常见的人感染病原体，其高危型HPV感染与多种肿瘤的发生密切相关，尤其是宫颈癌[20]。99.7%的宫颈鳞状细胞癌、94%～100%宫颈腺癌和宫颈腺鳞癌患者可检测到高危型HPV16、18或31型[21]。持续HPV感染可导致正常细胞向癌细胞发生转变，同时HPV病毒基因向宿主基因整合，也是疾病进展的一个重要步骤[22-23]。病毒基因组整合可诱导E6和E7激活从而抑制细胞抑癌基因p53和Rb的活性；病毒或宿主基因表观遗传修饰，影响基因表达。病毒基因上的一些甲基化修饰可能发生在宫颈癌疾病的各个阶段[22，24]。

3.1 HPV16型DNA甲基化

HPV16型持续感染与宫颈鳞癌的发生密切相关，研究发现其整合到宿主基因的DNA存在甲基化异常。Kalantari等[25]对HPV16基因组甲基化特异处理后进行测序，首次观察到病毒基因L1区3’末端甲基化异常且与病变进展相关，在宫颈癌样本中甲基化水平较高，而低级别宫颈病变样本中甲基化水平较低。Chang等[26]对85例HPV16型阳性的宫颈脱落细胞样本HPV16 L1开放阅读框架(ORF)进行甲基化检测，发现CINⅢ以上病变患者L1区ORF甲基化显著增加，提示该部位基因甲基化异常可能作为宫颈癌及癌前病变诊断的潜在标志。Divya等[27]检测HPV16基因E6启动子甲基化水平，发现病理学诊断正常的宫颈细胞E6甲基化水平明显高于细胞学异常样本，提示E6基因去甲基化变化可能与E6基因重新表达相关。Mirabello等[28]学者HPV基因组66个CpG位点甲基化情况进行检测，发现CINⅡ以上样本中88%CpG位点甲基化异常高于对照组，同时认为HPV16型DNA甲基化水平升高有望成为高级别宫颈病变的筛查指标。但Patel等[29]发现HPV16甲基化低水平和部分候选宿主基因甲基化高水平与高级别细胞学病变有关。因此，甲基化在宫颈癌的筛查中发挥的作用还需进一步证明。

3.2 其他型别HPV DNA甲基化

除HPV16型以外，其他型别HPV也存在甲基化异常。Mina等[30]研究104例样本，分别检测HPV16型、18型、31型和45型基因L2/L1片段甲基化水平。HPV18型中，宫颈癌病例中80%CpG位点存在甲基化，高于对照组11.9%，其他型别该片段甲基化水平存在同样趋势变化，该基因甲基化率随宫颈病变程度增加而升高。Turan等[31]同样证明了HPV18型基因在宫颈癌中存在高度甲基化，而无临床症状的感染者中表现为低甲基化水平或无甲基化。综上所述，研究者认为HPV DNA甲基化检测可能作为筛查或预测宫颈癌的生物学标志。

4 结论与展望

宫颈癌是危害妇女健康主要疾病之一，而宫颈癌的筛查和早期诊断则是宫颈癌防治的有效手段。目前大量研究表明，抑癌基因或病毒基因甲基化水平异常可导致基因表达水平降低或缺失，从而使疾病保护因素丢失，促进肿瘤发生。宫颈癌中普遍存在的基因甲基化异常可为宫颈癌的早期诊治及治疗后监测提供新思路。基因甲基化筛查可能成为未来宫颈癌筛查的主流方向，因此寻找特异性好、敏感度高且临床实践可行的甲基化生物学标志物将成为以后研究的重点。