美国临床肿瘤学会（ASCO）和美国病理学家协会（CAP）关于循环肿瘤DNA（ctDNA）检测研究进展概述

吴传松 史裕英 傅继欢 国家食品药品监督管理总局医疗器械技术审评中心 （北京 100044）

内容提要： 近日，美国临床肿瘤学会（ASCO）和美国病理学家协会（CAP）联合发表关于循环肿瘤DNA（ctDNA）检测相关的研究进展，主要针对实体瘤中ctDNA变异以及DNA序列或拷贝数情况，从样本前处理过程、分析性能研究、临床评价以及结果解读几个方面进行了分析。对未来的循环肿瘤DNA（ctDNA）相关研究提供了框架性建议，旨在更好地指引和规范ctDNA检测技术的发展和应用。文章通过对循环肿瘤DNA（ctDNA）检测研究进展分析总结，希望对我国循环肿瘤DNA（ctDNA）相关产品研制起到借鉴意义。

液体活检技术主要是对血液等体液样本中的循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cell，CTC）、循环肿瘤DNA（Circulating Tumor DNA，ctDNA）以及外泌体等进行的诊断分析技术，具有便捷、微创、便于动态监测、更容易整体反应患者肿瘤基因信息等优势，近年来在肿瘤诊疗领域备受关注，ctDNA检测已成为业界的研究热点[1]。用于ctDNA检测的方法主要包括基于聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术（如ARMS-PCR、数字PCR、BEAMing）和基于二代测序技术（NGS）。其中，基于PCR技术的ctDNA检测适用于检测单个或少量的特定的突变体，而基于NGS技术的检测通常设计覆盖不同肿瘤类别、多种基因、更大数量的突变类型[2]。

鉴于临床上越来越多的对循环肿瘤DNA（ctDNA）的基因变异进行的分析评估，美国临床肿瘤学会（ASCO）和美国病理学家协会（CAP）联合评审总结了当前临床应用ctDNA检测的相关信息，并为未来的研究提供了框架性意见。专家组对实体瘤ctDNA检测相关的文献进行了回顾分析，包括考量分析前变量、分析有效性、解释和报告、临床有效性和实用性。通过文献检索搜索了1338份参考文献，其中390份以及专家小组提供的31份参考文献被选中进行了全文评审，最终选中77篇文章汇总[3]。证据表明，ctDNA检测最好是采用含细胞稳定剂或EDTA管中收集的血浆样本，同时EDTA管应在采样后6h内进行处理。虽然一些ctDNA检测的临床有效性和实用性已在某些晚期癌种上得到证实，但绝大多数ctDNA检测缺乏足够证据支持其在晚期癌症中的临床有效性及实用性。证据还显示，ctDNA检测结果与肿瘤标本的基因分型结果并不完全一致，建议对肿瘤组织进行基因分型以确认在ctDNA未检出的结果。目前，ctDNA检测在早期癌症、治疗监测或残留肿瘤检测中应用的临床有效性证据非常有限，也缺乏相关的临床实用性证据。除临床试验外，无证据表明ctDNA检测对癌症筛查是有用的。鉴于ctDNA研究以及临床工具和指南的迅速发展，很快就需要再次评价相关文献。

1.样本前处理相关变量

在ctDNA检测样本前处理步骤中存在众多不确定因素，而这些变量可能会影响样本质量、DNA的提取等，从而影响后续的检测评价。

目前，研究表明最佳的样本类型是血浆，且最好采用含细胞稳定剂的抗凝管或EDTA抗凝管采集血液。采用EDTA抗凝管时，应在采样后6h内尽快处理，分离血浆。该过程中应尽可能降低白细胞溶解产生的大量细胞游离DNA对ctDNA的稀释影响。

整体而言，在样本抽血、采集、处理、储存、运输、DNA提取纯化等步骤中存在诸多可能影响后续检测的因素。此外，患者相关的生物学因素也可能会影响患者血液中游离DNA的释放，如吸烟、贫血、炎症类非恶性疾病、自身免疫性疾病等。而目前这方面的研究还很有限，诸多问题尚待解决。

2.分析性能研究

分析有效性指能准确、可靠地检出突变的能力，包括准确性、灵敏度、特异性、重复性等。目前，评价血浆ctDNA检测准确性和特异性的方法主要是通过与配对组织样本检测进行方法学比对。研究表明，血浆ctDNA检测与组织检测存在不一致情况，该情况除了受到分析性能（如分析灵敏度）的影响，也可能是其他生物学因素引起的，如癌症类别、肿瘤分期、肿瘤空间和时间的异质性、组织血浆取样时间差等。

由于血浆中ctDNA含量较低，对于检测下限的研究很重要，考虑到上述生物学因素可能的影响，建议纳入细胞系或人工构建的标准化的样本，对检测限附近的检出能力进行研究验证。目前，不同突变类型的最佳检测下限还未进行系统性研究，该检测限也可能将根据预期用途而变化。

此外，当前不同的ctDNA检测能力存在差别，未来的研究应考虑进行更多大型的跨平台比对研究。同时，下一步应综合考虑样本前处理和分析检测中的变量开展研究，确保检测质量。最后，建议应根据预期用途研究建立ctDNA检测最低的分析灵敏度和特异性，以促进其临床应用。

3.结果解读和报告

ctDNA检测结果的解读面临着一些特有的挑战，尤其应注意以下几点：

第一，治疗方案的选择是多种因素指导下的精细过程，包括肿瘤类别、等级、分期、患者身体状况、前期治疗方案以及遗传发现。根据原发肿瘤位置，相同的突变体可能有不同的治疗方案。当ctDNA报告显示对某一特定基因突变可以采取治疗措施时，需要加强注意。建议对潜在可采取措施的讨论限制为突变体与已建立临床有效性的治疗选择间的整体相关性，以避免对患者特定的治疗推荐，同时强调突变结果必须结合其他的临床诊疗信息来确定治疗方案。在可检测胚系突变的应用中，注意对于模棱两可的结果，或可能是胚系突变的结果进行后续的检测和解读。

第二，不同患者的ctDNA占血浆中总游离DNA的比例（也可称为纯度）存在较大差异，ctDNA检测的等位基因突变比率需要谨慎解读。不同分析前处理过程得到的样本中白细胞DNA相对含量也不尽相同。对意义不明的克隆性造血情形中的基因突变应谨慎解读。

第三，不同患者中ctDNA占总细胞游离DNA的比例差异较大，不同样本前处理过程得到的样本中白细胞释放的游离DNA也不尽相同，需要进一步研究ctDNA检测的基因突变丰度的预后意义。

第四，ctDNA检测结果可能与组织检测结果不一致，考虑到释放在血浆中的ctDNA含量通常较低，尤其是中枢神经系统癌症中血脑屏障的影响可能较大，因此对于未检出结果要进行谨慎解读和说明。

4.临床性能评价

一旦肿瘤标志物检测展现出准确的分析有效性，下一步就需要证明其临床有效性，更重要的是临床实用性。这些是医生和患者采用该检测做出治疗决策的基本因素。如果一个ctDNA检测的临床有效性未证实前，其具有临床实用性是不太可能的，但反过来并不成立。一个检测可能有临床有效性，但无临床实用性，证明临床有效性不能说明或暗示其也具有临床实用性。建立临床实用性的几种方法已经被提出，可通过前瞻性的临床试验或对之前的前瞻性临床试验中可获得的样本进行回顾性的表征。对于ctDNA检测，除非在样本收集、处理和储存过程中非常小心，否则之前提到的分析前问题将会导致后续检测的不确定性。

ctDNA检测可能被用于多个方面。此处，主要关注ctDNA检测在转移性癌症中的应用，ctDNA检测在其他方面的应用还缺乏相关显著证据。

文章根据ctDNA检测不同的预期用途，从以下几个方面展开，主要关注了在转移性癌症中的应用。

4.1 应用于晚期癌症中的治疗方案选择

ctDNA检测在该方面应用的研究相对较多，目前也有获批的基于PCR技术检测非小细胞肺癌患者中的EGFR突变状态的产品。其临床实用性主要是通过对之前的临床试验中获得的样本进行回顾性检测分析得到的。其中，需要特别注意的是，由于存在部分假阴性结果，尤其是在T790检测情形中，对未检出的结果应尽可能通过后续的组织检测进行确认。

目前有两种途径展示ctDNA检测的临床实用性以将其作为临床有效的检测方法。最可信的方法是开展前瞻性的临床研究来考察ctDNA临床实用性。到目前，还未有此类的临床试验报道。第二种策略是评价是否ctDNA检测可以提供和组织检测相同的信息。如果组织检测已经有明显的证据证实临床实用性，ctDNA检测发现二者间高的一致性或许可以表明ctDNA检测在指导患者治疗决策方面的临床实用性。

此外，由于晚期癌症中存在肿瘤异质性，ctDNA可能是来自所有的转移部位，而组织检测通常是在单一转移部位或原发病灶处进行的。高灵敏度的ctDNA检测可能检测到亚克隆突变，在不同情形中，亚克隆突变可能的影响还值得进一步研究[4]。

整体而言，除了已获得监管部门批准的检测外，大多数检测方法还没有充分证据表明其临床有效性，并且大都不具有临床实用性证据，接下来的研究应尽可能纳入与预期人群接近的患者，同时样本要经过严格的质控，开展前瞻性的临床研究充分验证其临床意义。

4.2 应用于疗效监测

ctDNA检测应用于疗效监测时，主要是定量检测ctDNA随时间变化的情况。然而在该过程还存在诸多挑战，包括考虑样本前处理和分析过程的有效性和可重复性的影响，需要研究验证不同实验室结果间的可互换性问题，建立量化DNA负荷的最佳单位等。

ctDNA水平变化与肿瘤响应或反馈之间的关系已经在少量研究中建立，包括了多种肿瘤类别，例如肺癌、结肠癌、乳腺癌、淋巴癌和黑色素瘤。此外，研究表明，与标准放射检测相比，ctDNA分析可以提前数月检测到耐药突变，为在疾病进展之前调整治疗方案提供了可能。

然而，由于缺乏ctDNA的监测应用方面的大规模前瞻性验证试验，临床有效性的可靠证据不足，更不用说临床实用性。已发表的研究大多数是回顾性的，且很少有与已建立的响应指标进行的严格比对试验。此外，与标准诊疗监测方法相比，没有研究证实该检测可以提高患者的疗效或费用的减少。同时，没有证据支持在临床进展之前根据ctDNA进展结果来调整治疗方案。最后，一些数据表明ctDNA检测响应存在与影像学检测响应不同步的情况，这或许会使ctDNA在监测方面的有效性验证变得复杂，同时也暗示该类研究最终除了要评估与放射成像响应的关联性，同时还需要评价临床结果。

4.3 应用于残留病灶的检测

ctDNA也有希望用于检测和监测经治疗后的残留肿瘤状况，可采用类似于目前临床中对白血病管理的常规方式，即在初期治疗后（或残留疾病减轻后）检测血液中白血病细胞。ctDNA可以在原发癌患者治疗前被检测到，然而与晚期癌症相比，其ctDNA水平更低。结肠癌、乳腺癌、胰腺癌和肺癌中的原理性研究表明，局部治疗（手术或常规放疗）后持续检测ctDNA可以预测高危复发人群。在这些研究中，通常采用测序来检测原发癌中体细胞突变情况，随后将在血浆中检测到的这些突变信息作为残留肿瘤的证据。但目前仍缺乏证据证明ctDNA可以检测到与最小残留病检测水平相近的低水平残留肿瘤，即与白血病管理中的情况相似。

目前的研究大都是回顾性的，在前瞻性研究中还未有相关发现，因此该方面的临床有效性证据是很有限的。没有任何试验在ctDNA检测的同时进行了系统性地成像检测以确认在此时肿瘤还未发生明显转移。该应用中，ctDNA检测的假阴性率（ctDNA检测阴性的患者发生复发）和假阳性率（尽管ctDNA检测阳性，但没有发生复发）还没有被充分研究确定，需要进行大规模前瞻性的研究来验证临床有效性。

理论上讲，用这种方法检测残留肿瘤的潜能在于根据ctDNA变化采取的早期治疗可能根治疾病或者预防或延迟复发。该方面的临床实用性还未明确，没有证据表明在ctDNA检测基础上采取的治疗提高了疗效。实际上，循环肿瘤蛋白标志物的前瞻性随机试验并未证明在乳腺癌和卵巢癌中对隐匿性复发的早期筛查可以带来生存获益，尽管有数据表明它们对结肠癌和前列腺癌是有帮助的。所以只能寄希望于未来的前瞻性随机研究来验证其临床实用性。

4.4 应用于无症状人群的肿瘤筛查

考虑到可以在早期癌症患者检测到ctDNA，ctDNA在无症状人群中癌症的早期检测方面的应用受到了关注。在对母体游离DNA进行胎儿非整倍体检测中发现的癌症病例引发了该方面的应用潜能。然而目前还没有相关的临床有效性和临床实用性数据，检测结果为假阳性（包括技术和生物学因素）的程度也尚未明确，其中假阳性情况包括健康人检测到癌症以及在判断肿瘤组织的来源时。当然也有可能在向转变进军但无临床意义的细胞中检测到循环肿瘤DNA突变。这种生物学的假阳性，也被称为过度诊断，在乳腺癌的乳腺X射线摄影筛查和前列腺癌的前列腺特异性抗原筛查中有发生。但目前对于实体瘤领域，还缺乏相关有效的临床有效性和临床实用性证据，对于检测假阳性（包括检测技术上和生物学因素）的程度也尚不明确。

5.总结

尽管ctDNA检测在肿瘤诊疗领域显示出诸多优势，但目前该技术在样本前处理、分析性能、临床有效性和临床实用性方面还有诸多待研究的问题，尤其在临床有效性和临床实用性证据方面，除了个别已批准的产品在一定程度上表明了其临床用途外，大多数用于癌症筛查、治疗方案选择、疗效监测、残留病灶检测领域的检测都缺乏有力的临床证据，现阶段不宜在临床广泛开展，接下来的研究中应尽可能纳入所有可能的预期人群类型，通过严格设计的临床研究来充分验证其临床意义。