不明原因复发性流产的免疫治疗策略

吴培莉 薛 晴 综述 杨慧霞 审校

北京大学第一医院(100034)

复发性流产(RSA)导致原因很多，包括染色体异常、感染、内分泌因素、子宫解剖结构异常、抗磷脂抗体综合征和其他自身免疫性疾病等[1]。但是，仍有约50%的RSA患者病因不明，称为不明原因的复发性流产(URSA)[2]，可能的原因是母体免疫耐受失衡[3]。免疫细胞失衡诱发的母体免疫不耐受与URSA的发生密切相关，其中两个最重要的平衡体系(Th1/Th2平衡和Th17/Treg平衡)是生理妊娠所必须的[4-5]。Th1和Th2细胞是具有不同细胞因子特征的T淋巴细胞亚群。Th17细胞是CD4+阳性且能够分泌IL-17的T淋巴细胞，其分泌的IL-17是一种能够诱导多种炎性因子表达的促炎因子。调节性T细胞能够分泌IL-10和TGF-β，抑制Th1和Th17介导的炎症反应。在正常妊娠的母胎界面，是以Th2和Treg细胞为主导的，但是在URSA患者的外周血和蜕膜组织中Th1/Th2及Th17/Treg比值往往升高。Th1/Th2和Th17/Treg的比例失衡是URSA免疫异常的重要因素[6-7]。本文就能够改善URSA免疫失衡的治疗策略相关研究进行综述。

1 子宫内膜干细胞样细胞治疗

子宫内膜干细胞样细胞包括间充质干细胞(MSCs)和上皮祖细胞，对月经脱落后子宫内膜的循环再生至关重要。MSCs是成纤维细胞样祖细胞的异质群体，其特征在于其自我更新和分化成各种细胞类型的能力。子宫内膜MSCs的减少不仅限制子宫内膜再生的内在能力，而且也影响子宫内膜蜕膜化，从而导致妊娠失败[8]。一项前瞻性非对照I期临床试验，纳入的26例复发性宫腔粘连致不孕的患者，在行粘连分解手术后，子宫腔接受1×107脐带来源的间充质干细胞移植，3个月后患者宫内粘连评分明显降低，30个月后随访发现其中10人成功妊娠[9]。MSCs的多功能性使其成为近几年被发现和研究的对象。

RSA患者的母胎界面存在Th1/Th2细胞因子的不平衡，而MSCs具有有效免疫调节功能，可调节Th1型细胞因子应答以促进Th2型优势的形成[10-11]。动物实验发现，具有流产倾向的小鼠在种植窗期通过腹腔注射接受同种小鼠脂肪来源的MSCs后，其胚胎吸收和流产率降低，同时，MSCs治疗能够明显抑制对抗父源抗原的脾脏细胞的增殖[12]。此外，研究结果表明，MSCs治疗增加了母鼠蜕膜和胎盘中Th2型因子IL-4，IL-6，IL-10和GM-CSF的分泌，同时降低了Th1型因子IL-12，IL-2和IFN-γ的表达，提示Th1/Th2平衡的改善是MSCs的治疗机制之一[12]。也有研究表明，骨髓来源的MSCs通过尾静脉注射给具有流产倾向的小鼠模型也得到相似结果[13-14]。但是目前尚缺乏临床证据。

2 免疫细胞或免疫球蛋白输注治疗

在母胎界面，绒毛滋养层细胞表面缺乏经典的主要组织相容性复合体(MHC)I类分子(除HLA-C外)和MHC II类分子，具有较弱的抗原特性。但妊娠期间这些细胞仍具有诱导母体免疫激活和产生抗父亲HLA抗体的能力，从而破坏免疫耐受。因此，妊娠期间，多种免疫细胞会被募集到母胎界面以确保和促进妊娠过程。蜕膜是母体免疫系统对胎儿抗原产生耐受性的重要场所，然而在URSA患者的蜕膜中免疫细胞的比例及功能均呈现不同程度异常[15]。

2.1 自然杀伤细胞(NK)输注

在早孕期母胎界面的母体蜕膜中，>70%的白细胞是NK细胞，胎盘形成后，NK细胞的数量骤减。NK细胞表面的特异性受体可以与蜕膜间质细胞及滋养层细胞表面的配体相互作用，介导NK细胞在早孕期母胎界面的独特功能，包括促进蜕膜螺旋动脉重塑，蜕膜化，滋养层细胞的侵袭和免疫平衡[16]。其中CD49a+Eomes+NK细胞占总NK细胞>80%，能够分泌多种促进胚胎发育生长的生长促因子。研究表明，复发性流产患者的蜕膜组织中，CD49a+Eomes+NK细胞所占比例显著下降，且生长因子的表达与正常对照组相比明显下降，这可能与复发性流产的发生密切相关[17]。动物实验发现，将体外诱导的子宫样CD49a+Eomes+NK细胞经尾静脉注射到孕鼠体内，细胞经检测能够到达孕鼠的母胎界面，并且能够释放胎儿生长所需的足够的生长促因子。因此该研究提示CD49a+Eomes+NK细胞的输注有望通过增加母胎界面生长促因子的水平来改善不良妊娠结局[17]。

2.2 树突状细胞(DC)输注

DC属于抗原提呈细胞，能够识别和处理捕获的抗原并将其呈递给T细胞从而激活T细胞启动适应性免疫反应。除了启动初级免疫应答外，DC还参与免疫耐受的诱导[18]。妊娠后蜕膜DCs会分化成占大部分的DC-SIGN+iDC和少量的CD83+mDC，提示蜕膜化与DC-SIGN+iDC的增加和CD83+mDC的减少相关。研究表明DC-SIGN+iDC细胞可在妊娠期间诱导Treg细胞的生成，促进子宫内膜蜕膜化、血管生成，募集NK细胞等，参与母体对胎儿抗原的免疫耐受[19-20]。既往研究也发现，URSA患者母胎界面的蜕膜中DC-SIGN+iDC较正常对照组明显下降[21]。将发挥免疫耐受作用的DC用于复发性流产的免疫治疗值得期待。已有动物实验表明，具有流产倾向的孕鼠在接受骨髓来源的DC静脉注射后，孕鼠的流产率(2/48，4.2%)显著低于对照组(11/42，26.2%)[22]。

2.3 调节性T细胞(Treg)输注

妊娠期间母胎界面胎儿抗原的存在能够诱导Treg细胞从外周血到母体脱膜，介导免疫抑制作用。Treg细胞表面表达或分泌的一系列分子可通过不同的机制直接促成其抑制功能。有研究表明，与正常对照组相比，RSA患者蜕膜中的Treg细胞不仅数量减少，而且免疫抑制效力也减弱(IL-10和TGFβ的分泌减少)[15]。有动物实验证实，CBA/J小鼠(n=10)在与BALB/c交配之前通过尾静脉输注同种属来源的由妊娠诱导形成的CD4+CD25+Treg细胞，可增加孕鼠母胎界面IL-10和TGFβ的表达，显著降低由外源性rIL-17诱发的孕鼠流产率(12/96，12.5% vs 28/101，27.7%)[23]。

但是，目前关于输注以上3种免疫细胞对于流产的治疗可能性仅局限在动物实验水平，尚缺乏临床数据的支持，但为未来临床URSA的治疗提供了更多可能性。

2.4 淋巴细胞治疗

封闭抗体是妊娠女性血清中含有的针对胚胎人类白细胞抗原Ⅱ和滋养细胞交叉抗原产生的IgG抗体，通过与滋养细胞结合或与母体淋巴细胞表面抗原结合，防止胚胎父系抗原被母体免疫系统识别触发的免疫攻击。对封闭抗体缺乏的RSA患者，采用配偶淋巴细胞免疫治疗(ALIT)后，大多数患者的封闭抗体会转阳。有研究指出ALIT治疗可调节外周免疫耐受异常，使机体在生理条件下对父系抗原产生耐受，其可能机制是通过提高CD4+、CD8+、CD3+、CD25+Treg细胞水平，促使Th1型细胞向Th2型转化，降低促炎因子IL-2、TNFα和IFNγ水平等[24]。

既往关于ALIT的临床治疗效果存在较大争议。20世纪末，ALIT提高URSA患者活产率的治疗效果被初步认识，但随后也有研究对ALIT的治疗效果提出异议。例如，一项对照试验的结果显示，与安慰剂相比，ALIT治疗组的活产率(31/86，36%)与对照组(41/85，48%)比较无统计学差异[25]。2011年由英国皇家妇产科医师学会颁布的复发性流产诊治指南也不推荐进行封闭抗体检查和ALIT治疗[26]。近几年已经鲜有关于RSA患者接受ALIT治疗的临床研究。但也有文献报道，ALIT的治疗效果与RSA患者接受其治疗的次数和注射方式不同有关，患者封闭抗体转阳率与接受ALIT治疗次数呈正相关。此外，在注射次数相同的情况下，皮内注射组封闭抗体转阳率高于皮下注射，且皮内注射诱导产生Treg细胞、纠正Th1/Th2平衡所需的时间更短[27]。所以，ALIT治疗效果的争议性可能与淋巴细胞的应用方法不同有关，需要针对淋巴细胞不同应用方法的更大样本量的临床研究来明确ALIT的治疗效果。

2.5 静注免疫球蛋白

静注免疫球蛋白(IVIG)是一种被动免疫方法，有研究提示IVIG可以中和循环系统中的自身抗体，增强Treg细胞介导的免疫耐受功能，并减弱Th17细胞依赖性免疫应答，促进Th1向Th2型细胞转化，抑制NK细胞毒性，减弱补体介导的细胞毒性免疫调控作用[28]。

有研究表明，URSA患者妊娠后静脉应用IVIG(400mg/kg),每4周1次直到妊娠32周结束，发现外周血中Th17细胞及炎性因子IL-17降低，Treg细胞及抗炎因子TGF-β和IL-10 升高，而且活产率(86.3%，38/44)较对照组(42%，21/50)高[29]。但IVIG是否对治疗URSA有效仍存在争议。Egerup[30]的一项meta分析指出，与安慰剂相比，IVIG治疗未能提高URSA患者的活产率，但是亚组分析发现IVIG可能会使继发性URSA患者受益。近期一项纳入1994年-2015年11项RCT研究的meta进行亚组分析发现，IVIG对原发性和继发性URSA患者的治疗均无明显效果，但妊娠前使用IVIG较安慰剂组会提高活产率(RR 1.67,95%CI 1.30～2.14,P<0.0001)[31]。因此，目前IVIG应用的指征和治疗方案尚不明确，其疗效及安全性也尚不统一，IVIG 是否应用于URSA仍存争议。

3 粒细胞集落刺激因子

粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的主要作用是促进嗜中性粒细胞增殖及其在骨髓中的分化，控制嗜中性粒细胞在血液中的释放。近些年，研究表明胎儿绒毛和母体蜕膜组织均能释放G-CSF，在妊娠女性血清中维持在高水平，不仅影响胚胎植入和卵巢功能，而且还促进子宫内膜修复，利于成功妊娠[32]。体外实验发现G-CSF可以抑制T细胞的异种反应性，使T细胞处于免疫低反应状态[33]。体内实验表明G-CSF可以诱导Th1向Th2细胞转化，降低Th17细胞水平，增加Treg细胞水平[34]。

Santjohanser等[35]进行了一项回顾性队列研究，将选择ART的127例URSA患者分为G-CSF治疗组(49例，72个周期)，以及未接受药物治疗和接受可的松或静脉注射免疫球蛋白或低分子量肝素治疗组(78例，127个周期)。G-CSF治疗组中11例患者接受1×34Mill单位/周的G-CSF，另38名接受2×13Mill单位/周的G-CSF，直至妊娠第12周，G-CSF组临床妊娠率和活产率均显著高于对照组；亚组接受1×34Mill单位/周G-CSF治疗的患者成功分娩率(72%)高于2×13Mill单位/周(21%)。所以，对于URSA患者，G-CSF似乎是一种安全且有前景的免疫治疗选择，但仍需更多的研究来优化治疗方案和评估药物安全性。

4 其他常见治疗药物

4.1 环孢素

环孢素A(CsA)是一种免疫抑制剂，广泛用于器官移植和自身免疫性疾病的治疗。C-X-C趋化因子受体4(CXCR4)和C-X-C趋化因子配体12(CXCL12)对于胚胎滋养层细胞和母体蜕膜细胞建立联系至关重要，参与母胎界面NK细胞的募集和胎盘植入等过程[36]。基础研究表明，CsA可以上调绒毛滋养细胞CXCL12/CXCR4的表达[37]。正常妊娠时，母胎界面Th1/Th2向以Th2型细胞为主的模式转化。研究表明CsA可增加滋养层细胞中Th2型细胞因子IL-4和IL-10的产生，同时抑制Th1型细胞因子IFN-γ产生，从而促进母胎界面Th2优势，介导免疫耐受[38]。动物研究也表明，低剂量CsA(1.0 mg/kg)可促进鼠母胎界面Th2型优势，促进绒毛细胞的增殖和侵袭，使具有流产倾向孕鼠的胚胎吸收率显著降低(9/86，10.47%比25/88，28%)，提示CsA的应用有助于胎儿免受母体的免疫攻击，维持正常妊娠[39-40]。一项前瞻性非随机对照试验，将纳入的URSA患者分为CsA治疗组(66例)和对照组(20例)，治疗组患者从被确认妊娠后开始口服CsA(100mg/d)共30d，对照组为黄体酮每天20mg直到妊娠12周。结果表明CsA治疗组的活产率(41/66，62.1%)显著高于对照组(6/20,30%)，而且妊娠女性没有出现明显副作用，未观察到胎儿宫内发育迟缓或出生缺陷[41]。研究提示低剂量CsA治疗可提高URSA患者的活产率，但目前CsA治疗URSA的临床研究尚少，其治疗效果以及安全性评估仍待大样本临床研究验证。

4.2 TNF-α抑制剂

TNF-α是Th1细胞分泌的炎性因子，在URSA患者的血液和蜕膜中的表达较正常女性明显升高[42]。高表达的TNF-α可以抑制滋养细胞的侵袭和增殖，促进滋养细胞和蜕膜螺旋动脉周围血管平滑肌细胞的凋亡[43]。

有研究表明，接受TNF-α抑制剂-依那西普治疗的URSA患者外周血中，具有毒性作用的NK细胞活性明显降低，尤其是在成功妊娠的URSA患者中。但是，依那西普治疗前后外周血中Treg细胞的活性未见明显变化，提示依那西普可能对有高NK细胞活性的流产患者是有效的治疗方法[44]。此外，一项回顾性研究表明，给予URSA患者联合应用抗凝剂、免疫球蛋白和TNF-α抑制剂组(17例)与仅联合应用抗凝剂和免疫球蛋白组(37例)相比，两组的活产率无明显差异，但可能是两组纳入人群数量小不足以产生有统计学意义的组间差异[45]。所以，更多的临床大样本前瞻性研究对于准确评估TNF-α抑制剂的治疗效果及安全性是必需的。

4.3 维生素D

维生素D除了参与骨代谢和矿物质平衡，还可以调控免疫系统，例如能够促进Th1向Th2型细胞的转化，促进Th17向Treg型细胞的转换，抑制T细胞的增殖等[46]。有研究发现，URSA患者蜕膜中维生素D 的表达较正常对照组降低，且维生素D的表达与母胎界面促炎因子IL-17和IL-23的表达呈负相关，与抗炎因子TGF-β的表达呈正相关[47]。研究也发现，URSA患者补充维生素D(0.5μg/d)2个月后，外周血IFN-γ+Th和TNF-α+Th细胞的比例会降低，NK细胞的毒性也会明显下降[48]。

一项双盲的临床药物研究，将纳入的伴有维生素D缺乏且近3个月未补充维生素D治疗的URSA患者分为药物治疗组(22例)和对照组(22例)，所有患者每隔4周接受3个疗程的淋巴细胞免疫治疗，同时治疗组接受1次300 000U维生素D的肌内注射，3个月后收集两组患者的血标本进行检测。结果显示两组Th17细胞的比例较治疗前均下降，但维生素D治疗组Th17细胞下降趋势更明显；Treg细胞的比例较治疗前均上升。治疗10个月后随访发现，对照组8例(8/22，36.4%)妊娠,其中6例在妊娠6～12周时发生流产，而维生素D治疗组10例(10/22，45.5%)妊娠，其中有5例已成功分娩，另5例持续妊娠中[49]。研究结果提示维生素D的应用对于改善URSA的妊娠结局有一定效果，但仍需大样本的RCT研究来明确能够使URSA患者获得最佳治疗效果的维生素D的最佳注射剂量和时间。

4.4 糖皮质激素

糖皮质激素具有显著的抗炎作用,能够抑制子宫内膜NK细胞的数量和活性，抑制树突状细胞对T细胞免疫的激活作用，抑制Th1型免疫，促进Th2型免疫，并能增加Treg细胞的生成促进免疫耐受[49]。但糖皮质激素能否改善URSA的妊娠结局仍存在争议。一项meta分析表明，与安慰剂组相比，泼尼松龙的治疗能够显著提高URSA患者的活产率(纳入2项RCT研究，RR 1.58,95%CI 1.23～2.02),降低流产率(纳入3项RCT研究，RR 0.42，95%CI 0.28～0.61)[51]。但是，有研究指出，妊娠期间应用大剂量泼尼松龙(40～50 mg/d)并没有提高RSA患者的活产率,反而会诱发早产、糖尿病、高血压等不良反应[52]；另一项研究发现，低剂量泼尼松龙治疗(20mg/d持续6周+10mg/d持续1周+5mg/d持续1周共计7周)使URSA患者的活产率比安慰剂组高出20%，但是由于样本量小，两组之间并无统计学差异[53]。研究结果提示加强低剂量泼尼松龙对URSA的治疗效果的探索是必要的。

综上所述，目前URSA的免疫治疗选择较多，但疗效仍存在争议，所以，大样本、多中心、前瞻性随机对照试验对于探索和制定合理有效的治疗方案尤为必要。此外，新的免疫治疗方向也仍在积极探索之中，期待尽快向临床应用转化。