应用有害结局路径思维把关乳制品雌激素安全

陈雪平，宋晓丹

（1.水中银（国际）生物科技有限公司（香港）香港，999077；2.圣元营养食品有限公司北京营养研究院，北京100020）

0 引言

雌激素安全是乳制品行业近年关注的焦点之一。虽业界及政府部门普遍认为牛奶中的内源性雌激素对于人体无害，国际研究却指出内源雌激素亦会干扰人体内分泌系统，且影响并不亚于外源性雌激素[1]。有鉴于此，文中以ChgH-GFP转基因鲭鳉鱼自由胚胎测试雌激素为例，首创提出应用“有害结局路径”思维把关乳制品雌激素安全。阐述通过测量雌激素“有害结局路径”中的某些位点，如被诱导ChgH基因的表达，来测量乳制品中的总体雌激素水平，并建议按照联合粮农组织/世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会设立的雌二醇每日允许摄入量[2]探讨乳制品的雌激素安全阈值。

1 乳制品中的雌激素内分泌干扰素污染问题

工业化的畜牧业基于成本效益，产奶的奶牛一般都处于怀孕期，导致生产的牛奶会有较高量的雌激素及孕酮。此外，使用雌激素、雌二醇及其衍生物于母畜身上亦有助于提高产奶量及延长产奶期，而激素的残留时间较长，养殖期间使用的激素很大可能会残留于牛奶中。除了牛奶中的天然激素及养殖过程中外加的合成激素，在乳制品制作过程中亦存在受雌激素内分泌干扰物污染的风险。有实验证明牛奶中的确含有一定份量的雌激素代谢产物[2]，并发现九成国内外婴幼儿配方奶粉含有会影响雌激素内分泌系统平衡的孕酮[3]。牛奶被视为人类吸收雌激素的主要食物来源之一。有研究发现，测试者饮用牛奶后血液及尿液中的激素含量的确有所提升[1]，证明乳制品中含有足以影响饮用者雌激素内分泌系统的物质。

联合国环境保护署和世界卫生组织于2012年发布的关于《内分泌干扰素现状》的联合报告中指出，雌激素会影响性器官及神经系统发育，可能引致生育能力下降，性早熟、肥胖、内分泌失调和精神紊乱，对于处于急速成长期的婴幼儿童影响尤其严重[4]。婴幼儿一旦受到荷尔蒙干扰，所造成的影响可能会到青春期才显示出来。有关雌激素类物质对猴子雄性婴儿影响的深入研究指出，雄性猴子于幼儿期间内分泌系统一旦受到干扰，除了导致延迟踏入青春期外，更会降低成年后的生育能力和骨质密度，并对神经系统造成永远久伤害[5]。婴幼儿奶粉为成长中婴幼儿的主食，其雌激素安全性问题必须重视。

2 雌激素作用机制及安全把关的挑战性问题

雌激素对生物体的主要功能是维护生理平衡和促进并维护女性的第二性征。雌激素对生物体的作用主要是通过与雌激素受体结合，启动雌激素信号传递通路，即调控雌激素受体下游基因表达来实现的。内源性雌激素的作用机制如此，外源性雌激素的作用机制也是如此，而某些本身不具雌激素功能的化合物则有可能通过干扰雌激素和雌激素受体之间的相互作用，从而起到增强或抑制雌激素活性的作用。由此可见，在讨论乳制品雌激素安全时，只是关注几种内源或外源雌激素是不够的。

我国农业部早在2002年就已禁止使用己烯雌酚等合成雌激素药物，并规定食品中不得检出该类物质。然而最新的《食品安全国家标准》有关乳制品的规定中并未列明关于雌激素的监管[6-8]。乳制品中雌激素水平测试多半停留在学术研究层面，且主要为气相色谱－质谱联用法，液相色谱－质谱联用法高效液相色谱－四极杆串联飞行时间质谱等化学分析方法[9-10]。这些方法虽可测出特定雌激素于样本中的精确含量，但程序较为繁复，且不能同时测试出未知雌激素。退一步说，即使化学分析可以测试出乳制品中所有的雌激素内分泌干扰素，目前的毒理学知识也还不足以评估多种物质混合在一起时的总体生物学效应。

3 应用有害结局路径评估乳制品雌激素安全

有害结局路径这个概念是2010年正式提出的[11]，是用于描述分子起始事件（如：雌激素与雌激素受体相互作用）与在生物不同组织结构层次（如：基因、细胞、器官、机体、群体）中出现的与危险度评定相关的“有害结局”之间的相互联系。有害结局路径已经成为了构建毒理学知识框架、以支持基于机理机制所进行的化学品安全评估的核心元素。当一种化合物与生物中的分子相互作用，经过一系列于生物不同组织结构层次中的传递，最终出现个体或社会群体层面的有害结局。整个有害结局路径可以用来概括某种化合物对生物造成的伤害，亦可以预测其它拥有相同生物活性的化合物对生物造成伤害的风险。总的来说，有害结局路径这一概念框架强调的是风险评估应着眼于有关物质对生物造成的伤害[12-14]。

将有害结局路径这一毒理学思路应用到探讨乳制品雌激素安全问题上时，关注的应该是雌激素所造成的“有害结局”，而非雌激素是属于内源还是外源性问题。原因在于不论是内源或外源雌激素，在生物体内都会启动雌激素信号传递通路，通过改变基因表达最终对生物造成“有害结局”。因此，通过检测和“有害结局”相关联的基因表达的改变更能保障食用者健康。

4 转基因鱼自由胚胎测试雌激素技术

基于对雌激素作用机制的深入了解和研究，我们基于雌激素的“有害结局路径”研发了应用转基因鲭鳉鱼（Oryzias melastigma）自由胚胎（eleutheroembryo）测试样品中的总体雌激素水平（雌激素当量，即相当于多少雌二醇）的技术[15-17]。雌激素对鲭鱂鱼的作用机制和对我们人体相似，也是通过和雌激素受体结合后启动雌激素受体下游基因表达的改变而造成“有害结局”的。鲭鱂鱼卵壳内膜蛋白基因ChgH是雌激素依赖的雌激素受体下游基因[18]。当带有卵壳内膜蛋白基因启动子连接着绿色荧光蛋白（GFP）基因编码区的转基因鲭鳉鱼自由胚胎遇到具有雌激素活性的物质时，其卵壳内膜蛋白基因启动子就会响应上游雌激素受体的调控，启动绿色荧光蛋白基因的表达合成绿色荧光蛋白。合成的绿色荧光蛋白的多少与雌激素量呈正相关。因此，将自由胚胎暴露于待测溶液一段时间（如24 h）后，于荧光显微镜下观察并测量绿色荧光蛋白的荧光强度，通过比较样品所诱导的荧光强度和雌二醇的荧光强度-剂量反应曲线便可计算出样品的雌激素质量分数。在24 h暴露的标准测试程序下，该方法对雌二醇的检测限为1μg/L。当样品和一定量雌二醇同时暴露时，该方法还可测出样品是否具有增强或抑制雌激素活性[19]。

5 转基因鱼自由胚胎测试的技术优势

转基因鲭鳉鱼自由胚胎测试雌激素当量技术是通过对雌激素“有害结局路径”中的雌激素受体下游基因ChgH的表达进行可视化实现的。由于ChgH是雌激素受体下游基因，该技术所测试的是和雌激素受体结合后成功启动了雌激素“有害结局路径”的物质，避免了假阳性结果的出现。同时该方法测试的是样品中的所有雌激素内分泌干扰素对于生物体造成的影响，反应了样品经过生物吸收，体内转化以及物质间相互作用后导致的最终生物学效应。

该测试应用的鲭鱂鱼是一种大小和生长周期都类似于斑马鱼（Danio rerio）的实验室动物模型，具有个体小（成鱼3～4 cm），繁殖力强(约200粒鱼卵/周/对鱼)，生殖周期短（从鱼卵到产卵期约为3～4个月），早期发育透明（方便观察）等优势。根据欧盟最新动物保护法[20]，鱼的胚胎和自由胚胎不被界定为动物，是国际科学家大力推崇以替代动物测试的方法之一。因此该方法为动物测试替代法。

6 转基因鱼自由胚胎测试乳制品雌激素案例示范

作者尝试将该技术应用于测试乳制品中的雌激素水平。于2012-2013年对香港市场上8大国际品牌之29个婴幼儿奶粉(其中有些是属于同一品牌同一阶段不同批次的奶粉)样品(表1)进行了收集和测试。样品经过有机溶剂提取后稀释于水溶液中，转基因鲭鳉鱼自由胚胎暴露于稀释液中24h后于荧光显微镜下测量所诱导的绿色荧光强度并分析计算出样品的雌激素质量分数。测试结果显示3大品牌之8个样品检测出雌激素活性（表1），其中5个为6～12个月婴儿奶粉，雌激素当量为14～64 ng/g雌二醇；2个为1～3岁幼儿奶粉，雌激素质量分数为80 ng/g雌二醇；1个为6～12岁儿童成长配方奶粉，雌激素质量分数为14 ng/g雌二醇。

表1 奶粉样品信息及雌激素质量分数测试结果

上述所测的大品牌产品在雌激素含量上应该都能达到法定要求，然而应用转基因鲭鳉鱼自由胚胎测试雌激素当量技术却发现多个产品具有一定量的雌激素活性。如果参照JECFA设立的雌二醇安全摄入量（0～50 ng/kg体质量）[2]，婴幼儿体重以及奶粉包装上建议的每日喂哺量，那5个6～12个月以及2个1～3岁阳性奶粉样品在雌激素安全问题上值得关注。这表明单靠现有法规在把关乳制品雌激素安全问题上存在风险。同时也证明了该转基因鱼自由胚胎测试技术可作为一种快速可靠的乳制品雌激素安全筛查工具，防止因雌激素，特别是法规外的雌激素内分泌干扰素污染而造成的乳制品安全隐患。

7 雌激素质量分数测试于乳制品行业的应用前景

当明白内源和外源雌激素都会对生物体造成相同的“有害结局”时，我们关注的不应该是乳制品中是否含有某种外源雌激素，而是乳制品中的雌激素总量是否达到对人体可能造成伤害的水平。根据有害结局路径这一毒理学概念，本文提出了通过测量生物体的“有害结局路径”中的敏感基因的表达量改变来量化乳制品的总体雌激素水平。从毒理学角度来讲这种毒理评估方式比只分析某一种或几种雌激素浓度更全面。根据国际食品法典委员会关于现代生物技术所产食品风险分析原则”（CODEX CAC/GL 44-2003），当和风险评估相关的新的科学信息可获得时应进行评估和予以采纳[21]。本文中所讲述的转基因鲭鱂鱼自由胚胎测试雌激素当量技术正属于“新的科学信息”，可用来有效测量和评估乳制品以及其它食品中的总体雌激素水平，从而帮助乳制品生产商和相关检测部门发现雌激素安全隐患、采取措施、提升产品安全！至于乳制品中雌激素当量阈值设置为多少方可确保食用者安全这一问题则亟待进一步研究。

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