半仿生法提取箬叶总黄酮的研究

龚乃超 锁进猛 张浩 乐薇

摘要：以箬叶为模型中药，采用正交试验对箬叶总黄酮的半仿生法提取工艺进行了优选。采用L9（3⁴）正交实验设计表，以箬叶总黄酮提取得率为考察指标，考察了提取温度、提取时间、料液比与乙醇体积分数对箬叶总黄酮提取得率的影响。结果表明：实验得到的半仿生法提取箬叶总黄酮的最佳工艺条件为：提取温度70℃、提取时间105min、料液比1： 30与乙醇体积分数80%，此时箬叶黄酮提取得率最高为2.26%。验证性实验表明半仿生提取法对比其他传统提取方法，具有提取效率高、设备简单、操作方便的优点，可供在生产中试行。

关键词：正交试验;半仿生;箬叶;黄酮

中图分类号：R282.2

文献标识码：A

文章编号：1674-9944（2018）6-0179-03

1引言

箬叶，又称粽叶，主要生长在我国长江以南。箬叶清香、叶片宽大、耐储存等特征使它成为端午时节的包粽子材料。经医学研究发现，箬叶还具有清热解毒，止血消肿，治疗排尿困难等药用价值，箬叶中含有丰富的黄酮类化合物、多糖、酚酸、蒽醌等生物活性成分，具有防腐、杀菌、抗癌、抗炎症、抗溃疡、抗肿瘤等多种作用显著，可广泛应用于食品、医药及日化用品等。故研究人员对于箬叶中化合物的提取分离备受重视，尤其是箬叶中的黄酮类化合物。但关于总黄酮的已有报道多采用的是热浸法、超声、微波法提取，该方法提取过程易使黄酮丧失天然活性。半仿生提取法是为生物制药所设计的一种新型的植物提取工艺：模仿口服药物在胃肠道的转运过程，采用活性指导下的导向分离方法而保证被提取物的生物活性的一种新型提取方法。

2实验仪器、材料及试剂

材料：箬叶（市售，产地湖北仙桃）;芸香叶苷（HPLC≥99.5%，标准品）成都西亚化工股份有限公司。

仪器：酸度计（上海亚荣生化仪器厂）;磁力搅拌器（上海亚荣生化仪器厂）;KQ-100E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）;SP752型紫外分光仪（北京君意东方电泳设备有限公司）。

3实验方法

3.1箬叶黄酮含量的测定

3.1.1标准曲线的绘制

准确称取芦丁10mg溶于30%乙醇溶液中，定容至100mL （贮存于冰箱中，室温下使用）。用移液管分别取O、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0mL于10mL容量瓶中，加入5%亚硝酸钠0.3 mL，使其混匀，放置6 min后加入10%硝酸铝0.3mL。摇匀静置6min后加入4mL4%氢氧化钠，以30%乙醇定容至刻度，摇匀静置10min后在波长510nm处测吸光度，参比为不加芦丁标准品的溶液。以测定的吸光度A为纵坐标，芦丁标准品浓度c为横坐标，绘制标准曲线，并计算相关系数（r）。

3.1.2总黄酮得率的计算

将箬叶黄酮浸提液定容至100mL ，再准确移取2.00mL 按标准曲线的绘制方法加入各种试剂，以不加黄酮提取液的溶液为参比，在波长510nm处测定吸光度，并按下式计算总黄酮得率：

公式（1）中：f为总黄酮的浓度（mg/mL）;，m为箬叶粉末的质量（g）;V为溶液的体积（mL ）; n为稀释倍数。3.2 半仿生法提取箬叶总黄酮3.2.1 箬叶黄酮提取

根据半仿生实验设计原则，模拟人体胃、小肠、大肠的体液pH值，用乙醇一水作为提取液，分别为0.9-1.5、7.6、8.3～8.5。

称取1.00g已经脱脂脱色的箬叶粉末，第1次提取：模拟人体胃pH值，用1mol/L的HC1调节pH值为2.0，分别在不同的时间、温度、料液比和乙醇浓度下提取，过滤，保留滤液、滤渣。用滤渣第2次提取：模拟人体小肠pH值，用磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲溶液调节pH值为7.5，在同样的时间、温度、料液比和乙醇浓度下提取，过滤，保留滤液、滤渣。用滤渣第3次提取：模拟人体大肠pH值，用磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲溶液调节pH值为8.4，在同样的时间、温度、料液比和乙醇浓度下提取，过滤，保留滤液。合并3次提取液，定容至100mL。按前文方法测定黄酮含量。

3.2.2正交试验设计

在粒度、提取工艺相同的条件下，考察提取温度（A）、提取时间（B）、料液比（C）与乙醇体积分数（D）因素对箬叶黄酮提取得率的影响，采用L9 （3⁴）正交表进行试验方案设计，实验因素水平设计方案见表1。

4结果与讨论

4.1芦丁标准曲线绘制

按照芦丁对照品浓度梯度与对应的吸光度绘制标准曲线，如图1 （f）所示，得回归方程：A=10.974C+0.00009，R²=0.9994，式中：A为吸光度值，C为芦丁的浓度（mg/mL）。

4.2不同因素对箬叶黄酮提取得率的影响

不同提取时间、时间比、料液比、提取温度与乙醇体积分数对箬叶黄酮提取得率的影响，见图1中（a）～（e）所示。

由图1中（a）～（e）可知，箬叶黄酮提取得率受到提取温度、时间与料液比等多种因素影响.其中提取温度.时间与料液比均呈现先上升后下降的趋势，而乙醇体积分数呈现先上升后不变，这是由于70%的乙醇对植物细胞壁的渗透作用最强，此时黄酮提取得率较大.进一步增加乙醇浓度，箬叶黄酮得率无明顯上升。时间比对提取得率的影响显示在3：1：2是效果最好，由此说明酸碱性对植物细胞的破壁效应明显。

4.3正交试验对箬叶黄酮提取得率的影响

4.3.1箬叶黄酮提取条件的确定

在单因素试验的基础上，为进一步研究提取温度（A）、提取时间（B）、料液比（C）与乙醇体积分数（D）四个因素对箬叶黄酮提取得率的影响进行考察，以确定半仿生法提取箬叶黄酮最佳工艺条件。本实验采用L9 （3⁴）正交试验，以箬叶黄酮提取得率为指标进行正交优化实验，实验方案及结果如表2所示。通过SPSS-18软件对实验数据进行方差分析。

由表2中极差R来看，正交试验所考察的4个因素对箬叶黄酮提取得率的影响程度为A>C>B>D。最佳的提取工艺为A2B2C3D3，即在提取温度70℃、提取时间105min、料液比1：30以及乙醇体积分数80%时箬叶黄酮提取得率最高。

4.3.2正交试验方差分析

由于正交表中所有的列都被因素占据了，没有空白列，从而无法得到误差的估计误差，对于这种情况应取各列偏差平方和中最小的近似当作误差的估计，这里选用因素D操作压力为误差估计，方差分析结果见表3。

4.4验证性实验

利用SPSS-18软件分析，由正交试验数据得出

得率最高时的最佳工艺条件：提取温度70℃、提取时间105min、料液比1：30与乙醇体积分数80%时，箬叶黄酮提取得率最大，并与传统热提取法、超声提取法及微波提取法相比较，见表4。

不同提取方法对箬叶黄酮进行提取结果如表所示，超声波提取法与微波提取法效果明显优于热提取，同样条件下半仿生提取法提取得率有所增加，但半仿生提取法采用的方式较为温和，模拟人体吸收系统，提取的黄酮类化合物天然活性较高。

5结论与展望

本次实验通过正交试验最终确定影响箬叶黄酮提取得率的因素的主次顺序为提取温度>料液比>提取时间>乙醇体积分数，最佳提取条件参数组合为：提取温度70℃、提取时间105min、料液比1：30与乙醇体积分数80%，在此最佳条件下，箬叶黄酮提取得率最高为2.26%。