木聚糖酶的分子改造方法及其工业应用研究现状

张燕青,张超群,王浩猛,3*

(1.天津科技大学 生物工程学院,天津 300222；2.北华航天工业学院 机械系,河北 廊坊 065000；3.康希诺生物股份公司,天津 300222)

木聚糖是一种多聚五碳糖,是植物半纤维素主要成分,是继纤维素之后的含量第二丰富的再生生物资源。主链由D-木糖通过β-1,4-糖苷键连接而成,侧链上连着多种取代基,主要有O-乙酰基、4-O-甲基-D-葡糖醛酸残基、L-阿拉伯糖残基等,故木聚糖属杂合多聚分子。且这些侧链与植物细胞细胞壁中其他几种多糖(如木质素、纤维素、果胶、葡聚糖等)以共价或非共价键连接故木聚糖的彻底降解需要多种酶参与[1]。广义的木聚糖酶指能将半纤维素木聚糖彻底降解一组酶的总称,包括多种内切酶和外切酶。通常说的木聚糖酶仅指内切-β-1,4-D-木聚糖酶(endo-β-1,4-D-xylanase)[EC3.2.1.8],主要降解木聚糖主链骨架,是木聚糖降解酶系中最关键的酶,由于其广泛应用于造纸、食品、饲料添加等方面,也是当前研究的热点,本文将主要介绍内切β-1,4-D-木聚糖酶(简称木聚糖酶)的一些生化特性,常用分子改造方法及其目前的重要应用[2-3]。

目前木聚糖酶的生产主要通过真菌、细菌等微生物获得,但表达量低,抗逆性差,很难满足工业生产需求,基因工程技术和蛋白质工程的快速发展成为解决这一缺陷的有效手段。该文介绍了木聚糖酶的生化特性,人工改良木聚糖酶的方法以及木聚糖酶的应用,以期推动酶制剂行业的健康发展。

1 木聚糖酶的生化特性

1.1 木聚糖酶的诱导性

木聚糖酶主要是诱导酶,木聚糖酶的生产除了和菌株本身的特点息息相关外,还与培养基中的诱导物密切相关。向基质中加入诱导物可以产生诱导效应或者阻遏作用,并且一种物质对于某一微生物生产木聚糖酶具有诱导活性,但对于另外一微生物可能是抑制剂[4-5]。研究证明,木聚糖自身是绝大部分木聚糖酶菌株的有效诱导剂。此外,某些小分子物质(如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、乳糖等)对不同菌株产酶的影响则不同,如葡萄糖、木糖对于一些菌株的产酶过程是诱导剂,而对于另一些菌株却有着明显的阻遏作用。

1.2 木聚糖酶的耐热性

不同来源的木聚糖酶的组成和性质差别很大,如来源于细菌和放线菌的木聚糖酶的最适温度为50～60℃,真菌木聚糖酶的最适温度为50℃左右,其耐热性比细菌来源的木聚糖酶差一些,嗜热微生物能产生耐高温木聚糖酶,更有利于某些工业化生产过程,如制浆过程是用高温蒸煮法除去木屑中的木质素。因此,用于纸浆漂白的木聚糖酶应是耐热的[6]。

1.3 木聚糖酶的耐酸碱性

不同来源的木聚糖酶的最适pH和pH稳定范围也各不相同。一般情况,来源于真菌的木聚糖酶为酸性木聚糖酶,最适pH值为4.0～6.0；来源于细菌和放线菌的木聚糖酶为中性或碱性木聚糖酶,pH稳定性较真菌木聚糖酶高,稳定于6.0～8.0,而极端微生物则能产生适宜于特殊环境的木聚糖酶[7]。现已有一些嗜酸性和耐碱性细菌的木聚糖酶基因通过载体构建以及受体菌的选择获得高效表达。

1.4 木聚糖酶普遍的糖基化现象

在许多真核微生物所产的木聚糖酶中还普遍存在糖基化现象,如耐温真菌(Talaramyces byssochlamydoides)YH-50的糖基组成为甘露糖、葡萄糖和核岩藻糖,Clostridium stercoraruan、Streptontycessp.和碱性耐温Bacillussp.等原核微生物的木聚糖酶也是糖蛋白,这也是木聚糖酶多样性的原因之一[8-10]。

1.5 木聚糖酶的其他性质

微生物来源的木聚糖酶分子质量在8 000～145 000 u,通常为蛋白质亚基；不同的木聚糖酶的等电点为3～10；不同来源的木聚糖酶的氨基酸组成差异性不大,主要为丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸、丝氨酸和苏氨酸等。

2 人工改良木聚糖酶的方法

为了获得酶学特性优良的木聚糖酶,科学家不断人工改良酶分子的方法。而常规的诱变育种方法由于难以在短期内达到预期目标,且操作过程危险,所以逐渐被基因工程或蛋白质工程技术取代。目前,人工改良木聚糖酶分子主要通过理性设计、非理性设计及介于两者之间的半理性设计来实现。

2.1 理性设计

根据已有信息通过改变或修饰酶分子中的个别氨基酸残基而产生具有预期新功能的酶分子突变体的方法,即为理性设计。

理性设计需要对所研究的木聚糖酶分子进行较全面了解,只有在掌握大量信息的前提下才能做出具有实用性的改造方案。经过大量的积累木聚糖分子结构与功能等相关方面的信息才能有目标的选取突变位点并对其做出改造。理性设计不仅需要对木聚糖分子的三维结构进行透彻的解析,而且还需要熟悉酶分子的一级结构与立体结构间复杂的对应关系,并作出合理判断,此外经修饰导致的特定区域内某氨基酸残基改变而导致的蛋白质构象的改变往往不能通过计算机辅助预测。但是随着研究的进一步发展,理性设计在分析和分子模拟对接的基础上,找出木糖酶结构上的关键位点进行相应改造,目标更为明确,操作相对简单,理性设计必将成为酶改造的主流方案。来源于黑曲霉(A.niger)的木聚糖酶XynB性质优良:高比酶活性,稳定性强,抗胃蛋白酶和胰蛋白酶,无纤维素酶活性等。作为饲料添加剂应用时该酶的热稳定性方面存在一定的不足。崔罗生[11]根据该木聚糖酶的空间模拟结构以及二硫键引入分析软件(Disulfide by design version 1.20)的分析结果,设计了定点突变位点,引入二硫键的同时将表面的Ser/Thr突变为Arg,在保持该酶上述优良特性的基础上,将木聚糖酶基因人工改良,从而提高了酶的热稳定性,更适应饲料生产的要求。

2.2 非理性设计

通过随机突变、基因重组等方法得到突变体库,然后采用定向筛选方法得到所需酶分子的方法,即为非理性设计。

非理性设计无需了解木聚糖酶分子准确结构及其他方面的相关信息。但此方法突变较为随机、实验周期长、工作量较大、筛选获得目的菌株几率低,给科研带来成果的同时,也将随着科研技术的进步而被逐渐取代。

2.2.1 改善木聚糖酶分子应用性能的改造方法

酶的体外定向进化(人为的分子进化)即体外模拟随机突变、重组和自然选择等自然进化机制,创造体外特殊条件,随机诱变天然酶基因,用高效简洁的筛选方法定向选出所需的突变酶。常用于木聚糖酶的体外定向改造获得突变酶库的方法有易错聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)、脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid,DNA)改组、串联重复插入、交错延伸重组、临时模板随机嵌合生长等。

易错PCR(error-pronePCR)和连续易错PCR(sequential error-pronePCR)改变普通PCR的反应条件(调整4种脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate,dNTP)的比例、添加Mn2+、上调Mg2+的浓度、使用较低保真度的Taq酶等)将碱基随机错配率相对提高,在原来序列上引入多出点突变,构建质量高,容量大的突变库,利用简便的方法筛选出优质的目的突变体,此方法即为易错PCR。介于该方法只在单一分子内部发生遗产改变,所以称其为无性进化。其耗时费力,故只用来对较小基因片段(＜800bp)进行改造。通常经一轮的易错PCR很难筛选到满意的突变株,故需连续多轮易错PCR(sequential error-prone PCR),该方法是将上一次易错PCR的有益突变基因片段作为下一次易错PCR的模板,依次循环连续地进行随机诱变,叠加每一次的有益突变而获得大幅度突变的结果。MCHUNU N P等[12]通过易错PCR的方法提高了一个来自疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)的木聚糖酶的耐碱性,突变体酶在pH 10.0、温度60℃的条件下酶活还可保持84%,而天然酶仅剩22%。WANG Y J等[13-14]利用易错PCR和基于DNA重排的家族重排技术,与蛋白质半理性设计相结合改良1个来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus Stearothermophilus)的木聚糖酶XT6的热稳定性,稳定性最佳的突变体酶含有13个氨基酸的替换,该替换导致其半衰期是亲本型的52倍,最适温度从77℃升高至87℃,催化效率提高90%。

DNA改组(DNA shuffling)和基因家族改组(DNA family shuffling)是一种在体外进行的同源重组的技术。对来源不同但功能相近的同源基因群进行改造,从而获得优势突变组合的蛋白。基本操作流程:选定基因,经过随机突变,生成带有不同突变的基因群,用DNase I随机切割,所得到的片段之间互为模板和引物进行多轮不添加引物的PCR,直至获得全长基因,最后加入依据完整基因两端序列设计的引物进行常规PCR,获得改组后的基因库。此方法能快速积累有益突变,具有理论和实际应用价值[15-16]。基因家族改组利用DNA shuffling技术,对在自然界进化上相关的一系列基因或基因家族进行同源改组。XIAT等[17]利用DNA shuffling技术使得来自于Strepto-myceslividans的木聚糖酶的耐碱性和热稳定性都得到改善,改良后的最优突变体在70℃条件下维持酶活性可达6h之久,并且该酶在pH 9.0环境下稳定性也有所增加。PARK Y M等[18]通过DNA shuffling技术对来源于Bacillus cereus的木聚糖酶基因进行研究,得到的突变酶YM20的最适pH有所提高(从5.5上升至6.5)。同时比酶活增幅较大,比亲本酶提高了350%。

串联重复插入(tandem repeat insertions,TRINS)通过滚环复制的方式将原始基因以两个或多个序列串联的形式插入到目的基因中。TRINS模拟自然进化过程中的复制插入机制,当没有合适的高通量筛选时,TRINS的优势就显现出来了。

交错延伸重组(stagger extension process,STEP)将带有不同点突变的模板进行混合,合并普通PCR的退火和延伸两步为一步,进而缩短反应时间,合成非常短的新生链,此后再以这些新生链作为引物随机地杂交到含不同突变的模板上,继续PCR,反复进行该过程,结果会得到含有模板上间隔序列的新生的全长基因,从而得到新性质的酶。

临时模板随机嵌合生长(random chimeragenesis on transienttemplates,RACHITT)是把随机切割的基因短片段杂交到一个临时DNA模板上,排序后进行修剪重复、填补空隙和连接的方法。其中临时模板是一条间隔一定序列插入尿嘧啶的单链DNA,悬垂切割获得更短的片段,然后进行重组。

各种新的构建酶分子突变文库方法的陆续出现,极大地推动了木聚糖酶定向改良技术,扩大了木聚糖酶制剂工业应用范围的同时也为高效准确地筛选目标木聚糖酶提出了难题。

2.2.2 提高木聚糖酶蛋白异源表达产量的分子改造方法

基因工程的迅猛发展已使得很多木聚糖酶蛋白产品实现了在工程菌株中的异源表达,由于影响木聚糖酶蛋白异源表达的因素较多,微生物酶分子设计时需关注的一个重要方面就是要消除影响外源基因表达的诸多不利因素,从而提高表达量。可应用于木聚糖酶改造良的策略有:改造信号肽、密码子优化和mRNA的二级结调整、截断表达、融合表达等手段。

改造信号肽:需要被运输到特定位置的多肽都含有一段称之为信号肽的氨基酸序列,将多肽引导至对应的位置。外源蛋白分泌至胞外,一方面消除了对宿主细胞的正常生长代谢的影响,另一方面避免了宿主对目的蛋白的降解,此外还可以提高纯化效率。因此通过目的基因自身的信号肽或表达载体的信号肽实现分泌表达来提高外源基因的产量是比较可取的生产方式。合适的信号肽甚至可使目的蛋白分泌到胞外的目的蛋白含量达到到胞外总蛋白的90%以上[19]。对于某些难分泌的蛋白,则可尝试采用其他的信号肽,或者对原有信号肽进行改造[20]。MOROSOLI R等[21]通过置换信号肽的方式提高了变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)的木聚糖酶产量,变铅青链霉菌的木聚糖酶A基因的信号肽在上游序列第57个核苷酸处被纤维素酶A的信号肽序列所置换,后者包括一个反向重复序列(5′-TGGGAACGCTCCCA),反向重复的3′末端包含一个盒子(TCCCA),它是和变铅青链霉菌的16S rRNA互补的。去除反向重复和盒子,木聚糖酶的产量减少了90%。还原反向重复序列,而盒子从5个核苷酸减少至4个,木聚糖酶的产量减少了40%。保留4个核苷酸的反向重复但把盒子从5个延长到6个核苷酸,能使产量增加1.5倍。去除反向重复并引入一个8个核苷酸的盒子,木聚糖酶产量将提高1.9倍,达到平均2.3g/L。最有效的盒子应为6～8个核苷酸,且位于第一个起始密码子下游第14～19个核苷酸。

密码子优化和mRNA的二级结调整:不同物种由于表达系统缺乏识别某些密码子的tRNA而具有密码子偏爱性。如果外源基因中含有较多的宿主菌非偏爱型密码子,就会严重影响其在宿主菌中的表达。由于密码子的兼并性,故可在不改变外源基因氨基酸序列的前提下,优化外源基因而提高外源蛋白的表达量。MECHOLD U等[22]将生物素酶(bacterialbiotinylationenzyme)BirA密码子进行优化后,其表达量提高5倍。YINE K等[23]根据大肠杆菌密码子的偏爱性和mRNA的二级结构对来源于Thermomyceslanuginosus的木聚糖酶基因进行优化,构建重组表达质粒pHsh-xynAl使得转录起始区的二级结构最低自由能由27.46 J/mol降至20.76 J/mol,且优化后的蛋白表达量显著提高。

截断表达:对于酶蛋白分子,其编码基因序列的有些区域并非酶活性所必须,特定的或随机截断某些基因片段,通过此种改造方法可改善酶学性质满足生产需要。其中截断位点可以是单一的也有进行多位点截留的。通过随机截断从而构建出截断库,然后筛选得到目的突变酶。HAI T等[24]通过对来源于Nostoc ellipsosporum NE1的藻青素合成酶的截短研究发现,截去C端45个氨基酸后该酶仍然保留全酶的活性,继续向上截去一个氨基酸Glu865,则酶活全部丧失,由此得出Glu865在是该酶活性中心的一个关键氨基酸,同时截断表达还可以协助研究酶特定氨基酸残基的功能。

融合表达:双功能酶是一条多肽链,能同时催化两个不同的生化反应。双功能酶通常效催效率比较高,由于反应发生在同一条肽链上。双功能酶的出现对生命体的生存有着重要意义,目前普遍认为是在自然进化的选择压力下,编码功能相关蛋白的基因之间的融合而形成的[22]。这样功能相关的基因同位于一条肽链上即可享用同一套调控元件,能高效方便地调控蛋白质表达。此外拉进空间位置增强了蛋白质间的互作。双功能酶通常由两个或多个结构域组成,如DAVIDS T等[26]从一株热纤维梭菌(Clostridium thermocellum)中分离得到一个由GH10家族木聚糖酶和酯酶组成的双结构域蛋白质。

2.3 半理性设计

在酶分子基因序列比对分析的基础上,找出潜在的关键氨基酸残基位点进行定点突变,通过验证核得到目标酶突变体,即为半理性设计(semi-rational design)。该方法相对非理性设计中的定向进化目标更明确、成功率无疑也提高了,而且不需了解木聚糖酶晶体结构,还避免了大量筛选工作,半理性设计改造策略成为了木聚糖酶酶分子改造的一种更合适的选择SRIPRANG R等[27]通过相关序列比对和分子构象动力学分析后,来源于Aspergillus niger BCC14405的木聚糖酶进行相关序列比并对其进行分析,选择性地将Ser/Thr平面的一些Ser和Thr用Arg替代,耐热性有所提高,热稳定性明显提高了18～20倍,由此证明了G/11家族在Ser/Thr平面引入Arg,有利于提高酶的热稳定性。

3 木聚糖酶的应用

3.1 面食方面

木聚糖酶在食品加工方面的主要应用是作为小麦面粉添加剂来改良面制品色香味各方面质量。小麦面粉中的戊聚糖非淀粉多糖(non-starch polysaccharides,NSPs)主要成份是阿拉伯木聚糖,含量虽然很少,但由于结合水的能力较高,对面团的流变性质和面食品质有显著影响[28]。阿拉伯木聚糖又包括水浸出性水不溶性阿拉伯木聚糖,其中水浸出性阿拉伯木聚糖有利于面食制品的烹饪加工,而水不溶性阿拉伯木聚糖则相反。木聚糖酶的添加能明显提高面团中水浸出性阿拉伯木聚糖含量,从而可以改良食品的质量。袁建国等[29]发现木聚糖酶在馒头加工中也具有独特的优势,尤其与葡糖氧化酶、淀粉酶、脂肪酶等复配使用效果更加明显,复配后木聚糖酶的添加量降低至40%～50%,其他各种酶的添加量也大大降低,经复配酶改良的馒头体积增大,口感轻柔,弹韧性好,且保鲜时间较原来延长了约1 d,但馒头的增白度有待加强,所以木聚糖酶与其他乳化剂或酶制剂复配仍需继续研究。李秀婷等[30]的研究结果表明,适量添加木聚糖酶后烘焙出的面包不仅质地洁白均匀、入口松软细腻而且过早老化的问题也得到了改善。顾宇峰等[31]发现在面包的生产中添加适量木聚糖酶后,面团的操作性能得到了明显改善,体积平均增大10%以上,同时面包心部分色泽比对照品更白,入口时的轻柔感更为强烈。

3.2 果蔬加工及酿酒方面

在酿酒行业,果蔬等加工过程中都需要较低pH的酸性木聚糖酶,但是目前报道的酸性木聚糖酶产量有限,活力低,耐酸性弱,但我国对于酸性木聚糖酶的研究还处于初期阶段。故利用基因工程等相关分子生物学技术深入对酸性木聚糖酶研究,满足生产需要的同时推动相关产业发展具有重要意义。

产业化酿酒中的木聚糖酶需满足以下3个基本特性:一是耐酸性,因为实际生产条件偏酸；二是底物特异性强,可以高效降解原料细胞壁中的木聚糖,使淀粉酶有效地发挥作用；三是产率要高,能够降低成本,实现经济可行性。酿制白酒以多种谷物为原料,固体发酵时,需充分水解除去纤维素、半纤维素、果胶等组分的外壁屏蔽作用,淀粉、蛋白质等有效成分的才能快速溶出,进而淀粉酶的糖化作用才能充分发挥,缩短糖化时间,提高发酵效率,增加酒精产率[32]。啤酒和葡萄酒酿造中在麦芽汁制备过程中添加外源性木聚糖酶和相关的多糖酶能有效降低麦芽汁黏度,从而提高麦汁的过滤速度和得率[33],同时啤酒和葡萄酒的质量和生产效率得到明显改善。植物细胞壁通常是由纤维素、半纤维素和果胶等组成的网状结构,要将新鲜的蔬菜、水果加工成果蔬汁、速溶果蔬粉等,首先需去除外层的网状结构。将木聚糖酶与果胶酶和纤维素酶按一定配比组合后就可以高效酶解掉细胞壁结构。殷露琴等[34]发现淀粉酶、木聚糖酶和纤维素酶混合使用可在一定程度上降低可可粉的粒径,提高可可饮料的溶解稳定性和饮料中可溶性固形物的含量。

3.3 保健方面

木聚糖酶在保健方面的应用主要是酶法生产功能性低聚木糖。目前,低聚木糖主要是以玉米芯、甘蔗渣、麦麸、稻壳为原料,制备得到木聚糖后用木聚糖酶水解获得。酶法批量生产低聚木糖首要改良该过程需要的木聚糖酶,以符合工艺需求、降低成本、提高产品质量、满足需求。我国对功能性低聚糖的开发起步较晚,对于低聚木糖制备生产工艺研究少,目前成品较单一远远满足不了市场需要。

功能食品低聚木糖具有良好的生理学功能:如增殖肠道内双歧杆菌、降低血脂、胆固醇、抗龋齿、低热量、促进钙的吸收等。此外低聚木糖还具有耐热、抗酸、防冻和不易消化、保存期长、降低水活度等优点,低聚木糖已成为国际新型低聚糖类产品,作为功能性食品添加剂广泛应用于食品业中。

3 结论与展望

目前前期的大量研究使得人们对木聚糖酶分子结构和酶学性质的相关性有了一定程度的了解,通过分子改造等生物技术得到了一些适合工业生产的改良蛋白酶,但还尚未形成系统的,具有指导性的,普遍适用的方法论。随着基因工程和蛋白质工程等高新技术的深入发展,科学的方法论体系必将在大量科研实践的基础上建成,从而创造出各行各业需要的性质优良的酶制剂在推动社会经济进步和人民生活水平提高,为酶制剂行业的健康发展做铺垫。

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