芪参益气滴丸对糖尿病心肌病大鼠心肌纤维化的影响

李良萍+冯越+杨家虎

[摘要] 目的 探讨芪参益气滴丸对糖尿病心肌病大鼠心肌细胞纤维化的影响。 方法 将成功构建糖尿病模型的30只Wistar大鼠随机分为对照组和治疗组，每组各15只。治疗组给予芪参益气滴丸混悬液35 mg/（kg·d）灌胃，对照组给予等量生理盐水灌胃。两组分别于第3、6、9、12、15周处死大鼠，每组3只。采用TTC染色观察心肌梗死区域，采用Masson染色觀察心肌组织胶原情况。 结果 Masson 染色显示第9、12、15周治疗组大鼠心肌间质胶原纤维较对照组减少。第12、15周治疗组大鼠心肌胶原纤维面积百分比低于对照组（P<0.05）。 结论 芪参益气滴丸具有抑制糖尿病心肌纤维化发生的作用，可预防糖尿病大鼠心肌纤维化。

[关键词] 芪参益气滴丸；糖尿病心肌病；大鼠；心肌纤维化

[中图分类号] R587.2；R542.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）35-0032-03

[Abstract] Objective To investigate the effect of Qishenyiqi dropping pills on cardiomyocyte fibrosis in diabetic cardiomyopathy rats. Methods 30 successfully constructed diabetic model Wistar rats were randomly divided into control group（n=15） and treatment group（n=15）. The treatment group was given Qishenyiqi dropping suspension 35 mg/（kg·d） gavage， and the control group was given the same amount of saline gavage. The rats in both groups were sacrificed at the third week， the sixth week， the ninth week， the twelfth week and the fifteenth week， with 3 rats in each group. TTC staining was used to observe the myocardial infarction area. Masson staining was used to observe the myocardial collagen. Results Masson staining showed that the myocardial interstitial collagen fibers in the treatment group were lower than those in the control group in the ninth week， the twelfth week and the fifteenth week. The percentage of myocardial collagen fibers area in the treatment group was lower than that in the control group in the twelfth week and the fifteenth week（P<0.05）. Conclusion Qishenyiqi dropping pills can inhibit the occurrence of diabetic myocardial fibrosis and prevent myocardial fibrosis in diabetic rats.

[Key words] Qishenyiqi dropping pills； Diabetic cardiomyopathy； Rat； Myocardial fibrosis

糖尿病心肌病（Diabetic Cardiomyopathy，DCM）是糖尿病发病过程中发生的特异性心肌损伤，是糖尿病的主要并发症之一。一般认为长期的糖脂代谢紊乱影响糖尿病患者心肌组织的代谢，引起心肌微血管病变，导致大范围的心肌结构异常，从而发生左心室肥大、收缩及舒张功能障碍，最终可导致心力衰竭的形成。糖尿病心肌病的主要病理改变为心肌细胞肥大、凋亡和心脏间质纤维化。这种病理生理改变与高血压、心肌缺血等损伤因素无明显关联[1]。芪参益气滴丸是由黄芪、丹参、三七、降香经科学配伍，提取有效化学成分精制而成的现代中药滴丸剂型，方中重用黄芪，取其大补元气，使气旺以促血行，祛瘀而不伤正；气旺以促津行，行津利尿，则水肿自消。丹参具有活血祛瘀、通经止痛的效果。三七具有通络作用，与丹参共为臣药。降香气香辛散，温通行滞。诸药合用益气活血，利水消肿，通络止痛，得以气血运行正常，诸证自愈[2]。许多现代药理研究也从不同的研究方向为芪参益气滴丸改善心脏功能的作用机制提供了依据[3-5]。本研究通过建立糖尿病心肌病大鼠模型，探讨芪参益气滴丸对糖尿病心肌病大鼠心肌纤维化的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

40只Wistar大鼠，雄性，体重200～220 g，8周龄，购于浙江省实验动物中心，生产许可证号：SCXK（浙）2014-0001。所有动物于浙江省实验动物中心屏障环境饲养，使用许可证号：SYXK（浙）2014-0008。

1.2 药品与试剂

高脂高糖饲料（浙江省实验动物中心制备），链脲佐菌素（STZ）（Sigma公司，批号：WXBC2044V），羧甲基纤维素钠（成都市科龙化工试剂厂，批号2014052901），芪参益气滴丸（为中药提纯浸膏，主要成分为黄芪261 g、丹参240 g、三七42 g、降香19 g，由天津天士力制药股份有限公司生产），三诺安稳血糖测试仪+三诺安稳血糖试条（试条批号：2622NK），0.9%氯化钠注射液（浙江莎普爱思药业股份有限公司，批号：130629-2），碘伏（德州欣瑞达消毒制品有限公司，批号：120712）。endprint

1.3 糖尿病大鼠模型构建

40只8周龄Wistar大鼠，适应饲养1周后，给予高脂高糖膳食4周，促发胰岛素抵抗，继以腹腔注射2次链脲佐菌素（STZ）（25 mg/kg+m2），间隔2 d]。观察大鼠的状况，于第2次腹腔注射STZ第6天，测量禁食血糖（FBG）、随机血糖，以2次禁食血糖（FBG）≥11.1 mmol/L或（和）随机血糖≥16.7 mmol/L為糖尿病大鼠成功造模标准[6]。

1.4 动物给药

将上述成功构建糖尿病模型的大鼠30只随机分为治疗组和对照组，每组各15只。称取一定量的芪参益气滴丸，用0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）配成芪参益气滴丸混悬液。治疗组给予芪参益气滴丸混悬液灌胃，每日给药剂量为35mg/kg。对照组予以等量生理盐水灌胃。两组分别于灌胃第3、6、9、12、15周处死大鼠，每次两组各3只。

1.5 观察指标

1.5.1 TTC染色观察心肌梗死区域 分别于灌胃第3、6周后，麻醉快速处死治疗组和对照组大鼠，取新鲜的心脏组织，置于-20℃速冻30 min。将冷冻的心脏组织制作成切片，厚3～5 mm，连续切片；将组织切片置于装有TTC染色液的器皿中，37℃避光孵育20～30 min，在孵育过程中，需观察样本的颜色变化；取出染色后的组织切片，用组织冲洗应用液将组织表面多余的染色液冲洗掉；肉眼观察并拍照分析。

1.5.2 Masson 染色观察心肌组织纤维化程度 治疗组和对照组大鼠分别于第9、12、15 周灌胃治疗后，称体重，然后麻醉快速处死，取新鲜的心脏通过组织包埋，制作切片。分别进行Masson丽春红和苯胺蓝染色，封片后于显微镜下观察心肌组织纤维化情况。每只大鼠取切片两张，200倍下随机选择视野6处，应用Image J软件进行图像分析，计算心肌胶原纤维面积占整个心肌组织面积的百分比。

1.6 统计学方法

应用SPSS22.0软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，所有数据经正态检验及方差齐性分析，采用两独立样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TTC染色结果

TTC（2，3，5-氯化三苯基四氮唑）是脂溶性光敏感复合物，是呼吸链中吡啶核苷结合酶系统的质子受体。TTC 与正常组织中的呼吸酶反应呈红色，而缺血组织内呼吸酶活性下降，不能反应，不产生变化呈白色，即非梗死区染为红色，梗死区染为灰白色，红色区与白色区之间为缺血区，实验结果见封三图2、3。根据结果图片，心肌组织经 TTC 染色后仍为红色，未发现灰白色区，所以第3周、第6周糖尿病心肌病大鼠未见明显心肌梗死区域。

2.2 Masson 染色结果

Masson 染色时胶原纤维呈蓝色（被苯胺蓝所染），肌纤维呈红色（被丽春红所染）。对照组大鼠心肌间质、血管周围蓝色胶原纤维明显增多，排列紊乱；治疗组大鼠心肌间质胶原纤维较对照组明显减少。实验结果见封三图4～6。

2.3 对照组与治疗组大鼠心肌胶原纤维面积百分比比较

第12、15周治疗组大鼠心肌胶原纤维面积百分比较对照组明显减少。见表1、封三图7。

3 讨论

随着目前糖尿病的高发，糖尿病心肌病也呈现上升趋势。Framingham心脏研究中心的研究显示：糖尿病患者罹患心力衰竭的可能性是同龄健康对照男性的2倍和女性的5倍[7]。

糖尿病心肌病被定义为糖尿病所致患者的心肌运动功能障碍及心脏结构改变[8]。但目前糖尿病导致心肌损害的发病机制尚不明确，在糖尿病心肌改变过程中存在细胞氧化损伤、糖脂代谢异常以及心肌细胞外基质沉积等病理改变[9，10]，与心肌微血管病变、大范围心肌结构异常相关，从而发生左心室肥大、收缩及舒张功能障碍，最终可导致心力衰竭的形成。尽管众多的临床和流行病学数据均表明糖尿病患者罹患心肌梗死的风险明显增加，且早期和晚期的死亡率均高于非糖尿病患者，但关于糖尿病动物模型对缺血的敏感性仍然存在争议。对此，目前的研究多认为与糖尿病的严重性、病程、实验动物的种属、动物模型（体内或体外）及操作过程有关[11，12]。本研究中第3、6周糖尿病心肌病大鼠的心肌组织经TTC染色后未见明显心肌梗死区域，可能与大鼠的糖尿病病程较短有关，具体原因值得进一步探讨。

现代医学的发展使得中医药对糖尿病心肌病也有深入的研究。芪参益气滴丸包含黄芪、丹参、三七以及降香，提取其中有效的化学成分制作而成。许多现代药理研究从不同的研究方向为芪参益气滴丸改善心脏功能的作用机制提供依据。长期高血糖时，由于葡萄糖转运因子1与4的损耗，葡萄糖由外界进入心肌细胞的速度及数量均下降，导致心肌细胞供能障碍[13]。同时体内过量的糖自身代谢增加，产生大量反应性氧簇（ROS），启动氧化应激反应，导致糖基化终末产物（AGEs）过度积累，AGEs可联合细胞内外胶原组织并导致纤维组织积累[14]。黄芪的主要活性成分之一是黄芪多糖，具有双向调节血糖的作用，对正常小鼠的血糖含量无明显影响，但却使葡萄糖负荷后小鼠的血糖水平显著下降，并能明显对抗肾上腺素引起的小鼠血糖升高反应和苯乙双胍致小鼠实验性低血糖[15]。黄芪多糖可减少糖基化终末产物（AGEs）的过度积累，进而减少细胞内外胶原组织的增生。大量的ROS以及一系列异常糖类代谢中间物的积累可导致心肌细胞炎症及DNA损伤，从而引起异常基因表达并启动一系列细胞凋亡程序[16]。三七总皂苷是三七的主要有效成分，近年研究发现三七总皂苷对多种实验性炎症模型具有良好的抗炎活性，可促进抑制性核转录因子（NF-κB）的表达从而抑制相关炎症因子的生成[17]。王大英等[18]研究证实降香可降低 AngⅡ水平，调节心肌Bcl-2和Bax蛋白表达，减轻心肌细胞凋亡。心肌细胞坏死所致的炎症反应可促使心肌成纤维细胞大量分泌胶原组织并沉积于细胞外基质。最近研究发现，细胞外基质重构是糖尿病心肌病的重要发病机制，包括细胞外基质胶原沉积、胶原成分和构型的改变。胶原的沉积、胶原的过量生成与组织型金属蛋白酶抑制剂的分泌密切相关。丹参的有效成分为水溶性的丹参素和脂溶性的丹参酮，具有提高机体抗凝和纤溶活性、抗凝血和抑制血栓形成、抑制血小板合成和释放前列腺素类物质、抑制血小板聚集、降低全血黏度、改善微循环障碍、阻断羟自由基的产生、阻止脂质过氧化的作用，是一种有效的氧自由基清除剂[19]。研究显示，丹参酮ⅡA对糖尿病心肌病的作用是通过TGF-β1/Smad途径，减轻线粒体超微结构的变化，抑制心肌细胞凋亡，能够增加左心室射血分数以及左室收缩末压，左室舒张压也显著增加，显著改善左心室功能[20]。丹参具有改善心肌微循环、改善心肌细胞供能、减少心肌细胞炎症及坏死的作用，从而减少心肌成纤维细胞分泌胶原组织，最终减少心肌纤维化。本研究结果显示第12、15周对照组大鼠心肌间质、血管周围蓝色胶原纤维增多，排列紊乱；而芪参益气滴丸治疗组大鼠心肌间质胶原纤维较对照组明显减少，因此本文认为芪参益气滴丸具有抑制糖尿病心肌纤维化发生的作用，可预防糖尿病大鼠心肌纤维化。endprint

心肌纤维化是糖尿病心肌病的常见表现，也是最终导致心力衰竭的主要原因。芪参益气滴丸通过抑制心肌纤维化的程度，延缓心肌病的进程，从而起到改善心肌病的作用，对糖尿病心肌病具有一定的治疗作用。目前对糖尿病心肌病的病理过程尚未完全阐明，多种损伤机制仍有待完善，而且较单一的化学药物而言，芪参益气滴丸的有效成分多种多样，其对糖尿病心肌病的具体作用和机制值得更进一步的探讨，以期为糖尿病心血管并发症的防治提供理论依据。

[参考文献]

[1] Voulgari C，Papadogiannis D，Tentolouris N. Diabetic cardiomyopathy：From the pathophysiology of the cardiac myocytes to current diagnosis and management strategies[J].Vascular Health & Risk Management，2010，6（6）：883-903.

[2] 龙文，罗建华，周桂花. 芪参益气滴丸治疗慢性心功能不全疗效分析[J]. 井冈山医专学报，2006，13（1）：47.

[3] 张新友. 芪参益气滴丸治疗糖尿病心脏病合并心功能不全的临床疗效观察[J]. 中国伤残医学，2016，24（2）：99-100.

[4] 冉永玲，戴小华. 芪参益气滴丸治疗糖尿病心肌病心功能不全临床疗效观察[J]. 中医药临床杂志，2016，（6）：811-815.

[5] 耿志辉. 三七总皂苷对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护研究[J]. 吉林医学，2007，28（11）：1261-1262.

[6] 林心君，王麒又，辛金钟，等. 高成模率和高稳定性的糖尿病大鼠模型制备——高脂高糖膳食+STZ体重联合体表面积法构建糖尿病大鼠模型[J]. 中国老年学杂志，2013，33（9）：2051-2054.

[7] Kannel WB，Mcgee DL. Diabetes and Cardiovascular Disease：The Framingham Study[J]. Jama，1979，241（19）：2035-2038.

[8] Amaral N，Okonko DO. Metabolic abnormalities of the heart in type Ⅱ diabetes[J]. Diabetes & Vascular Disease Research，2015，12（4）：239.

[9] Frustaci A，Kajstura J，Chimenti C，et al. Myocardial Cell Death in Human Diabetes[J]. Circulation Research，2000， 87（12）：1123-1132.

[10] Cai L，Li W，Wang G，et al. Hyperglycemia-Induced Apoptosis in Mouse Myocardium Mitochondrial Cytochrome c-Mediated Caspase-3 Activation Pathway[J]. Diabetes，2002，51（6）：1938-1948.

[11] Liu Y，Thornton JD，Cohen MV，et al.Streptozotoein-induced non-insulin dependent diabetes protects the heart from infarction[J].Circulation，1993，88（3）：1273-1278.

[12] Ravingerova T，Neckar J，Kol？觃r F.Ischemie tolerance of rat hearts in acute and chronic phases of experimental diabetes[J].Mol Cell Biochem，2003，249（1-2）：167-174.

[13] Eckel J，Reinauer H. Insulin action on glucose transport in isolated cardiac myocytes：Signalling pathways and diabetes-induced alterations[J]. Biochemical Society Transactions， 1990，18（6）：1125-1127.

[14] Pappachan JM，Varughese GI，Sriraman R，et al. Diabetic cardiomyopathy：Pathophysiology，diagnostice valuation and management[J]. World J Diabetes，2013，4（5）：177-189.

[15] 李先榮. 注射用黄芪多糖药理作用的研究：3.对血糖及其肝糖原含量的影响[J]. 中成药，1989，11（9）：32.

[16] Fang ZY，Prins JB，Marwick TH. Diabetic cardiomyopathy：Evidence，mechanisms，and therapeutic implications[J].Endocrine Reviews，2004，25（4）：543-567.

[17] 胡志洁，张志耘. 三七总皂苷对心脑血管的药理作用研究[J]. 天津药学，2006，18（6）：51-55.

[18] 王大英，李勇，范维琥，等. 降香和红景天对心肌梗死大鼠胶原比值的影响[J]. 中成药，2007，29（12）：1834-1835.

[19] 孙建波，梁军，闫玉仙，等. 复方丹参滴丸的临床应用及作用机理[J]. 现代中西医结合杂志，2002，11（11）：1087-1088.

[20] Shen N，Li X，Zhou T，et al. Shensong Yangxin Capsule prevents diabetic myocardial fibrosis by inhibiting TGF-β1/Smad signaling[J]. Journal of Ethnopharmacology，2014， 157：161.

（收稿日期：2017-09-13）endprint