临床应用软骨组织工程技术修复关节软骨缺损的进展

尤奇，段小军，杨柳，刘毅

(1.遵义医学院附属医院关节外科，贵州 遵义 563003；2.第三军医大学西南医院关节外科，重庆 400038)

关节软骨缺损在临床中的发病率极高，是导致肢体残障的主要原因，并给社会造成了巨大的经济损失[1]。关节软骨血液供应的贫乏使得其修复显得尤为困难，并长期困扰着广大临床医生。该缺损常表现为顽固性疼痛和进行性关节功能减退，最终可引起退行性骨关节炎[2]。Curl等[3]对美国31 516例膝关节损伤患者行关节镜探查，发现有63%的患者存在不同程度的软骨损伤。据统计，美国每年有30 000～100 000例软骨缺损患者需要手术治疗[4]。在2000年，美国骨关节炎治疗费用达600亿美元，预计到2020年骨关节炎花费将增加到1 000亿美元[5]。近年来，随着再生医学和材料学的迅速发展，软骨细胞、软骨组织以及支架材料运用于软骨缺损的修复均取得了显著的效果，而且其修复组织的结构和生物力学性能近似透明软骨。现就软骨组织工程技术在临床上的推广应用进行综述。

1 传统治疗方法

临床上治疗软骨缺损的传统方法很多，但每种方法均有其局限性，并不能很好的满足临床要求。a)保守治疗虽能够暂时缓解临床症状，但对于软骨缺损直径大于4 mm的患者几乎无修复作用，更不能恢复其生物学组织结构和功能。b)关节清理术只是对关节局部病灶的清理，仅能改善症状并不能修复软骨缺损。c)骨髓刺激术常用于较小的缺损，形成的多为纤维软骨，其结构组成和生物力学性能相较于透明软骨差[6]。d)骨软骨移植术分为自体骨软骨移植和同种异体骨软骨移植，自体骨软骨移植手术操作简单而且是一期手术，但面临着软骨来源有限和供区并发症等不足[7]；同种异体骨软骨移植可以修复较大的软骨缺损，但存在着免疫排斥和疾病传播的风险。e)人工关节置换术面临术后骨溶解、远期关节功能退变以及费用高等问题。以上治疗方法虽能暂时改善关节活动功能，但长期效果还不能满足临床要求。

2 软骨组织工程

随着材料学、再生医学以及相关生物化学的迅速发展，Langer等[8]提出了组织工程的概念，组织工程学综合了材料学、再生医学以及相关生命科学的基本原理和方法，将分离、提取的细胞体外培养扩增，然后复合于组织相容性良好、可降解吸收的的三维支架材料上，形成具有生物活性的复合物，然后植入体内修复病损部位。近年来，软骨组织工程技术经过前期大量有效的基础实验的验证，该技术已经应用于临床，未来有着广阔的发展前景。

3 新技术的临床应用

3.1 软骨细胞移植 软骨细胞移植(autologous chondrocyte implantation，ACI)是将分离、获取的自体软骨细胞先进行体外培养扩增，然后将扩增的细胞按一定的密度移植于软骨缺损的部位，进行软骨缺损的修复。研究表明，体外扩增培养的软骨细胞能够较好的维持其细胞特性，利于软骨缺损的修复[9]。ACI对于治疗中等软骨缺损、骨软骨炎引起的软骨缺损具有良好的修复效果，但尚不适用于有关节炎症、传染性疾病以及局部感染等患者。

1989年，Grande等[10]报道了兔自体软骨细胞移植治疗膝关节软骨缺损，术后16周软骨缺损得到修复，并且修复区域表现为透明样软骨组织，此为第1代ACI技术，即骨膜-自体软骨细胞移植术(periosteal autologous chondrocyte implantation，P-ACI)。1994年Brittberg等[11]应用该技术成功治疗了人关节软骨缺损，这为该技术在临床中的推广应用奠定了坚实的基础。1995年美国Genzyme公司利用该技术生产出了Carticel®产品，1997年后该产品逐渐在临床得到推广应用。2000年Peterson等[12]报告了101例膝关节软骨缺损的患者接受ACI治疗后的随访情况，其中对94例患者进行了2～9年的随访，结果证明其临床有效率达87.5%以上，但术后存在骨膜脱落、细胞逸散、骨质增生、骨膜肥大等并发症。后来Haddo等[13]用一种Ⅰ/Ⅲ型胶原双层支架薄膜代替骨膜进行对照研究，通过1年的术后随访，该方法取得了良好的临床效果：不仅无骨膜肥大、剥脱等并发症，同时此方法避免了因获取骨膜而增加的额外创伤，该技术被视为第2代ACI技术，即胶原膜-自体软骨细胞移植术(collagenic autologous chondrocyte implantation，C-ACI)。Niemeyer等[14]对第2代ACI技术(C-ACI)治疗的23例膝关节软骨缺损的患者和第1代ACI技术(P-ACI)治疗的23例膝关节软骨缺损的患者进行了随访，术后10年通过Lysholm和IKDC评分进行比较，证明了C-ACI的临床长期疗效要优于P-ACI。Filardo等[15]报道了用C-ACI治疗的58例患者，在术后第2年和第6年进行了随访，结果显示膝关节功能得到明显改善，但存在细胞分布不均匀和胶原膜脱落。随着组织工程技术的不断发展，部分学者将软骨细胞种植于仿生支架材料内形成复合体，然后利用有活性的复合体去修复软骨缺损，该技术被称为第3代ACI技术，即基质诱导的自体软骨细胞移植术(matrix-induced autologous chondrocyte implantation，MACI)。Kon等[16]应用MACI技术对141位患者治疗后随访，76%的患者疼痛消失，88%的患者运动功能恢复正常。Gille等[17]用MACI技术对38位患者进行了治疗，术后15年进行随访，结果证实86%的患者膝关节运动功能得到明显提升，100%的患者膝关节功能都要好于术前。典型代表产品为修复较小缺损的Hyalograft®C(NeoCartTM)和修复较大缺损的Novocart 3D®(NeoCartTM)。最新的MACI使用生物相容性较好的纤维蛋白凝胶进行粘合，避免了术中手术缝合，简化了以前复杂的操作步骤，缩短了手术时间，降低了细胞外漏的风险，软骨缺损修复效果更好。有研究者采用患者自体非负重关节的软骨组织，切成1～2 mm的软骨片，复合可生物降解的凝胶移植到软骨缺损处修复缺损，将该技术称为第4代自体软骨细胞移植技术。在前期动物实验研究的基础上，DePuy Mitek公司制造了自体软骨移植系统(cartilage autograft implantation system，CAIS)，经美国FDA批准，该技术已应用于临床研究。Cole等[18]第1次将CAIS应用于临床研究，分别应用自体软骨移植和微骨折技术对29例膝关节软骨缺损患者进行治疗，结果表明：在术后6个月、12个月，CAIS组膝关节运动功能明显好于微骨折组；术后24个月，磁共振检查两组缺损修复没有明显差异，但微骨折组有较多的骨赘生成。虽然CAIS移植取得了良好的修复效果，但CAIS移植面临着供区移植组织受限和供区并发症的缺点。后来，DePuy Mitek公司发起了大规模的临床研究，但由于收录注册的患者数量不足以及资金问题而没有做长期研究。现将4代ACI技术的优缺点归纳总结见表1。

3.2 成体干细胞移植 间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有成软骨分化能力，而且体外实验已经证实具有旺盛的软骨基质分泌能力[19-20]。MSCs增殖能力较强，复合仿生支架材料后修复软骨缺损效果较好。因此，MSCs曾被认为是软骨组织工程比较理想的种子细胞。但后来有学者研究发现，将MSCs分化来源的软骨细胞体内移植后会出现不同程度的钙化现象，但出现钙化的具体原因尚且没有确切的结论，可能与细胞体外诱导培养后碱性磷酸酶以及X型胶原表达增多有关[21]。

表1 四代ACI技术比较

2002年，Wakitani等[22]将MSCs复合纤维蛋白凝胶治疗创伤性膝关节炎，术后24个月关节镜和组织学检查结果证实，软骨缺损被透明软骨所修复，但遗憾的是患者的临床症状并没有得到明显改善。Kuroda等[23]用MSCs复合I型胶原凝胶治疗一位股骨内侧髁软骨缺损20 mm×30 mm的患者，术后7个月经过关节镜及组织学检查证实，在缺损处有透明软骨样组织生成，术后1年患者膝关节功能明显改善，无疼痛和并发症发生，但是磁共振检查结果显示新生组织表面不规则。Nejadnik等[24]报道对72例膝关节软骨缺损患者分别用MSCs移植和第1代自体软骨细胞移植术治疗，术后随访两组治疗方法都可以改善患者膝关节症状，但两种治疗方法的治疗结果没有明显差别。

MSCs虽然具备取材容易、分离简单等优点，但仍存在取材部位损伤、干细胞数量有限、形成的修复组织表面不平整等缺点，而且形成的类透明软骨组织与自体软骨组织在生物力学性能上还有差距。虽然MSCs移植修复软骨缺损在动物实验和临床应用中还未发现有致瘤性，但这种可能还不能被排除，未来还需进一步观察和研究。

3.3 同种异体幼年软骨微粒移植 近年来，同种异体幼年软骨微粒移植已经应用于临床研究，特别是在美国临床中已经取得重要进展。该技术首先获取捐赠的13岁以下幼年关节软骨，制作成1 mm×1 mm×1 mm的软骨微粒备用，当手术确诊关节软骨缺损后，可以一期将软骨微粒复合仿生凝胶固定于软骨缺损处，然后按计划康复训练，该技术避免了细胞体外培养带来的表型难以维持等缺陷。Zimmer公司随后采用该策略开发出软骨修复移植物商品，即天然组织移植物商品(DeNovo natural tissue，DeNovo-NT)，该产品已经应用于美国临床。Farr等[25]报道了前瞻性对照研究结果，结果显示：术后患者的膝关节疼痛症状明显缓解，运动功能明显提高。对部分患者进行关节镜探查并取材分析，结论是初步疗效满意。Arshi等[26]和Buckwalter等[27]的近期研究也得出类似的结论。Mcmillan等[28]报道了在全关节镜下应用幼年软骨微粒修复全层股骨滑车缺损，该技术避免了传统膝关节手术所引起的并发症，但该技术缺少专门的工具能够使移植物在缺损处分布均匀，而且移植材料或纤维蛋白凝胶有溶解可能。Kruse等[29]用同种异体幼年软骨微粒治疗1例踝关节软骨缺损的患者，术后6个月踝关节已能完全活动，术后24个月踝关节疼痛症状消失，缺损修复良好。Hatic等[30]、Saltzman等[31]的近期研究也得出相似的结论。同种异体幼年软骨微粒也用于其他关节软骨缺损的修复，如肘关节、髋关节。Dunn等[32]报道了同种异体幼年软骨微粒修复肘关节软骨缺损，术后6个月随访，肘关节疼痛减轻，功能改善，MRI检查显示软骨缺损得到修复。Pascual-Garrido等[33]报道了关节镜下应用同种异体幼年软骨微粒修复髋关节软骨缺损，术后12个月随访证实，髋关节活动功能明显改善，疼痛消失，软骨缺损得到修复。有报道称同种异体幼年软骨微粒移植对于中度的髋关节软骨缺损(2～5 cm2)有较好的修复效果，但缺乏长期的临床追踪报道结果，因此，还不能对其远期疗效做出客观评价。

该技术为异体来源组织，理论上存在疾病传播、免疫排斥、移植物加工过程污染等风险，而且该技术的一些关键的修复机制尚待阐明，目前尚未见中国大陆应用该技术修复软骨缺损的研究报道。

3.4 应用新型生物材料 随着支架材料的深入研究，有研究者提出了用无细胞仿生支架修复软骨缺损的新方法。2013年Schüettler等[34]通过关节镜手术用无细胞的I型胶原支架治疗1例膝关节软骨缺损的患者，术中患者软骨下骨保存完整，术后42个月随访，患者膝关节运动功能提高，疼痛症状消失，MRI显示缺损得到修复。修复组织HE染色有软骨细胞生成，新生组织免疫组化检测结果显示有新生的Ⅱ型胶原。后来，Filardo等[35]报道用I型胶原和羟基磷灰石构成的具有通透性的三维支架治疗27例剥脱性骨软骨炎的患者，术前采用开放性手术暴露软骨缺损并清除硬化的软骨下骨，术后2年随访膝关节功能改善明显，磁共振显示软骨缺损得到修复，但大部分患者有不均匀的再生组织和软骨下骨的形态改变。Brix等[36]通过关节镜手术用无细胞的纳米支架治疗8例膝关节软骨缺损的患者，术中清除部分软骨下骨，术后分别于12、18、24个月进行随访，有7例患者无细胞支架与周围骨完全愈合，5例患者有软骨下骨化，磁共振检查结果显示修复组织并非是透明软骨样组织。

新型生物材料的应用避免了细胞提取、分离的复杂步骤，避免了软骨细胞体外培养表型不稳定的缺点，为临床修复关节软骨缺损提供了新思路和新方法。然而，该技术修复软骨缺损有软骨修复不全、软骨形态改变和骨赘形成等缺点，这些缺点导致该技术未能在临床进一步推广应用。单纯的支架材料，其成软骨修复活性往往不足，还不能很好的满足临床需求，有基础研究提示复合生长因子后可提高软骨修复能力，但是有关该技术临床的有效性及安全性尚未知晓。

4 临床应用进展

目前文献报道的主要治疗关节是膝关节，Siebold等[37]将自体关节软骨细胞体外培养形成三维微球体，然后移植于30例患者软骨缺损处，术后进行随访，86.6%的患者生活质量得到明显提高，疼痛减轻，膝关节功能改善，Mocart评分和磁共振影像证实膝关节稳定性良好。Mumme等[38]第1次将人的自体鼻软骨细胞用于膝关节软骨缺损的治疗，他们将体外再生成软骨能力更好的鼻软骨细胞复合于胶原支架上，然后移植于25例患者膝关节软骨缺损处，术后24个月随访，患者疼痛症状减轻，膝关节运动功能明显提高，新生的软骨组织结构和生物力学性能接近于正常组织。该实验还需对其远期疗效做进一步观察，观察是否能够抑制或消除骨关节炎的发生。踝关节、肘关节、髋关节有少数报道，Dunn等[32]、Pascual-Garrido等[33]也报道了肘关节、髋关节软骨损伤的修复结果。

5 展 望

软骨组织工程技术应用于关节软骨缺损虽然仅有短短30余年，但已展现出广阔的临床应用前景。近年来，随着再生医学、材料学以及生物化学的迅速发展，组织工程技术已从基础研究转化应用到临床。传统的治疗方法虽能改善症状，但并不能形成组织结构和生物力学性能类似于透明软骨的组织。应用组织工程技术不仅能够明显改善症状，而且能够形成透明软骨样组织，其生物力学性能接近于自体软骨组织。然而，还要认识到该技术目前所面临的问题，例如：a)自体软骨来源受限、供区不稳、供区并发症；b)软骨细胞体外扩增，表型不稳定出现肥大化；c)支架材料存在机械强度和组织诱导活性不足；d)组织界面整合欠佳；e)远期观察新生组织容易退变等[12]。因此，未来还需进一步探讨种子细胞、支架材料以及体内修复机制等。一旦以上关键问题得到解决，该技术将会很快在临床得到推广和普及。

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