内皮祖细胞促进皮瓣存活的研究进展

李苗钟 梅 劲 王 欣 章伟文

(宁波大学医学院附属宁波市第六医院，浙江 宁波 315211)

目前皮瓣移植术在解决缺损覆盖、塑型重建等方面发挥着巨大的作用。近年来，随着干细胞研究的不断深入，基于干细胞介导的治疗性血管生成重建血运逐渐得到重视。内皮祖细胞(EPCs)作为血管前体细胞，在介导血管重建和恢复血运方面发挥着重要的作用〔1,2〕。本文就近年来EPCs促进缺血皮瓣存活方面的研究进展做一回顾。

1 EPCs参与血运重建

EPCs可来源于外周血、骨髓、脐带血、脾脏、胎肾、胎肺、血管壁及脂肪组织中〔3～5〕。个体在出生后的血管再生从血管形成发展到血管发生和血管生成。血管发生是由EPCs动员、迁移、增殖及分化，在原位形成原始毛细血管网，而血管生成是在原本存在的血管网基础上，血管内皮细胞迁移、增殖并重塑，形成新的成熟血管。研究〔1，6～9〕显示，EPCs促进血运重建的作用可用于血管新生、内皮再生、心血管病治疗、缺血性部位的治疗、肿瘤的治疗、组织工程、基因治疗等领域。

2 EPCs干预缺血皮瓣

2.1直接注射EPCs 血运障碍是皮瓣移植术后最常见的并发症，严重者可大块组织坏死或导致手术完全失败，同时其他常见的并发症还有：血肿，皮瓣撕脱和感染。这些并发症的发生主要是由于静脉回流不畅造成的。由于EPCs具有对缺血组织定向迁移的特性，不但可以归巢聚集于心肌和缺血肢体，同样也可以聚集于缺血的皮瓣，理论上应具有良好的治疗效果。

研究表明，在一些针对缺血皮瓣模型的研究中，增加损伤部位EPCs的数量能加快局部组织的血运重建，促进皮瓣的存活〔10〕。骨髓源性或脐带源性EPCs在近似圆形、正方形、长方形还是狭长形的随意皮瓣研究中都能明显加速皮瓣缺血、缺氧组织的血运重建，改善皮瓣缺血缺氧状态，提高皮瓣存活面积及成活质量，提高皮瓣毛细血管网密度，增加血管引流，改善皮瓣淤血状态，从而保持组织较好的弹性和色泽〔11〕。EPCs在血管生长因子的诱导下，分化组成新生血管中约占26%的内皮细胞〔12〕。EPCs能提高皮瓣存活面积，主要机制可能与其参与组成并促进微血管新生有关。皮下注射可促进形成局部新的微血管网，后者在皮瓣静脉回流不畅、代谢物堆积、微循环系统进行性恶化时能提供低流量的血流，建立微循环系统，促进淤血组织的存活〔13〕。

2.2间接上调EPCs：生长因子 EPCs的动员、迁移、归巢和增殖往往受多种生长因子、趋化因子、炎症因子等因素的影响。碱性成纤维生长因子(bFGF)是维持EPCs表型的必需因子，缺乏时可影响后者形成管状结构的能力〔14〕。并且还能通过激活磷脂酶C-γ和血小板生长因子-BB通路促进EPCs的迁移、增殖和分化〔15〕。有研究者〔16〕为研究EPCs对狭长窄蒂皮瓣模型的作用时，在皮下均匀注射重组人生长激素，观察bFGF的表达和皮瓣的存活。结果表明注射重组人生长激素的大鼠皮瓣中bFGF表达及微血管数明显增加，能间接通过EPCs的增殖促进微血管新生，改善局部缺血缺氧状态，扩大皮瓣存活面积。同时还有一些研究人员通过基因转染等方法研究EPCs和皮瓣存活之间关系。易成刚等〔17〕利用脂质体介导血管内皮细胞生长因子(VEGF)165基因体外转染EPCs,并移植于裸鼠随意皮瓣。观察发现,体内EPCs数量有所增加,说明基因转染后的EPCs在体内增殖分化能力较强,而且EPCs均整合入裸鼠的新生血管内膜中。说明表达的VEGF165蛋白有明显的促进EPCs增殖的作用,同时VEGF可促使EPC 分化参与血管内膜的修复。实验表明，无论是直接应用VEGF、重组人生长激素等生长因子或与之相关基因治疗手段，促进EPCs内皮化，还是直接注射，增加EPCs的数量，都能加快血管形成和血运重建〔18〕。此外EPCs本身也可以分泌VEGF，基质细胞衍生因子(SDF)-1α等趋化因子，并且通过自分泌和旁分泌效应促进血管生成过程〔19〕，提高随意皮瓣的存活率和存活面积、还能改善轴型皮瓣及游离皮瓣的远端血运情况、减少带蒂皮瓣断蒂时间的影响〔20〕、缩短皮瓣内形成功能血管所需时间、加速扩张皮瓣扩张速度。

3 EPCs干预微血管病变

内皮细胞受到损伤和微循环出现障碍是微血管病变发生的基础，糖尿病(DM)引起的DM足及DM溃疡的始动因素正是内皮损伤。而EPCs可大量增殖分化为成熟的内皮细胞，修复内皮细胞并排列形成新的血管网，增加微血管的血流灌注。提示EPCs在治疗微血管病变方面有潜在的应用前景。肾脏是一个富有血管的脏器之一，常常作为微血管病变的靶器官。Yuen等〔21〕将健康大鼠造成慢性肾损伤模型，即右肾切除，左肾结扎两根肾动脉分支达到2/3肾梗死，假手术组做双肾剖腹探查及术后伤口缝合处理。实验动物给予健康大鼠来源的EPCs移植，结果显示肾功能明显恢复，肾小球滤过率(GFR)明显提高，效果与血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)或血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(ARB)类似。此外，EPCs能还能减少慢性肾损伤大鼠尿蛋白含量，增加肾小球与间质的微血管密度，缓解肾小球硬化和小管间质的纤维化。后来有学者用DM小鼠来源的EPCs重复了上述研究，得到相似的结论，验证了DM小鼠来源的EPCs同样具有治疗价值〔22〕。Zhang等〔23〕进一步探讨证明了无论是给予来源于非DM还是DM小鼠来源的EPCs，移植到DM肾病小鼠体内后，均可减轻白蛋白尿的进展和系膜基质增生的程度。提示治疗与微血管病相关的皮肤损害可以从改善微血管内皮功能着手。杨晨等〔24〕通过EPCs移植小鼠后肢单侧缺血模型，发现经过细胞移植后缺血后肢的毛细血管密度，血流灌注及坏死程度相较对照组有明显改善。彭艳等〔6〕也对DM大鼠下肢缺血造模，得到了类似的结论。Kim等〔7〕将EPCs移植到4例患有Buerger病的患者上，发现治疗后他们的静息痛很快缓解了，4 w后坏死的皮肤损伤也完全愈合了，血流动力学方面也有很大变化，远端毛细血管的数量和管径明显提升，血管阻力明显下降。EPCs在改善系统性疾病、创伤等引起的微血管病变和局部循环障碍中都能分化成内皮细胞，参与微血管新生、血运重建，修复微血管网等，从而延缓疾病进展，改善预后。

4 影响EPCs时作用发挥的因素

4.1EPCs的功能下调或数量减少 引起EPCs作用的发挥减弱的原因:①直接抑制了EPCs的生成或加快其凋亡；②细胞数量没有变化，但是其功能有所下调。研究〔8〕发现高龄与缺血部位的血管重建能力降低有关，并且能导致心血管相关并发症的高发和组织恢复能力的减弱〔9〕。有实验表明高龄能下调EPCs的作用，并且其EPCs本身数量与年轻的大鼠相比并无显著改变，经过进一步的研究发现这是和高龄大鼠体内缺乏缺氧诱导因子(HIF)-1α稳定剂有关，通过对高龄大鼠补充铁鳌合剂去铁胺就能够逆转这一作用，从而增加血流、改善缺血部位的血运情况〔25〕。

相反，在高血糖的状态下，EPCs的敏感性被增强了，但是其数量和增殖能力大大减少了，总体的作用表现为减弱〔26〕。在以高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)相对缺乏的高脂血症的患者中EPC的数量和功能都表现为下调，然而EPCs在HDL-C正常的高脂血症患者中的数量和功能并未受到影响〔27〕。血管内皮依赖性舒张素(EDV)在心血管防治中起着重要作用〔28〕，并且被证实为是EPCs的保护因素〔29〕。而EPCs在HDL-C正常的高脂血症患者能维持正常的功能和数量，正是后者对EDV的保护作用。所以HDL-C是影响高脂血症患者体内EPCs作用的主要决定因素。除此之外，此类患者的EPCs还与C反应蛋白(CRP)、活性氧(ROS)、酶的表达活性有关。吸烟能够增加CRP、ROS的反应，减少HDL-C、HDL-C，降低酶的活性。因此吸烟等引起长期慢性血管损伤、氧化应激、HMG-coA还原酶增加的因素都是引起缺血时降低EPC作用的危险因素〔30〕。

进一步的研究发现,蛋白激酶B(Akt)在缺血部位EPCs发挥血管重建的过程中起着中心环节的作用。研究人员〔31〕对转染Akt基因和沉默该基因的对比研究发现，沉默组的EPCs募集和重建血管能力大大减弱，而转染组比正常对照组的能力还要增强。并且凋亡蛋白Bim能使得EPCs凋亡，而叉头转录因子(FOXO)4能促进Bim的上调，Akt的磷酸化能引起FOXO4的磷酸化，从而抑制EPCs的凋亡，增加募集和重建血管能力。因而任何能引起凋亡蛋白Bim的减少，或FOXO4表达下调，或Akt的非磷酸化都能引起EPCs数量的减少〔32〕。

4.2EPCs功能上调或数量增加 对高龄大鼠补充铁鳌合剂去铁胺，逆转HIF-1α稳定剂，能改善EPCs在缺血部位的发挥血运重建的功能，其中关于HIF-1α与EPC之间机制关系尚待进一步的研究。另外在Akt-FOXO4-Bim这条途径中，引起磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)增加，促进Akt的磷酸化，减少凋亡蛋白Bim的生成均可增加EPC功能的发挥。研究发现，音猬因子(shh)蛋白，他汀类、鱼腥草等药物能够通过PI3K/Akt途径刺激EPCs增殖、迁移，抑制其凋亡〔33，34〕。

HDL-C是EPCs的保护因素，而雌激素能够上调HDL-C的表达，因而女性肥胖者体内的EPC数量和质量相对男性肥胖者要高。另外，一些细胞因子如VEGF，SDF-1α，缺血组织通过HIF-1α、胰岛素样生长因子(IGF)等也都能刺激增加EPCs的表达，增强后者的血管重建能力。也有研究发现适当的体育锻炼，减少氧化应激反应能增加血管抗损伤能力，增多血管因子的数量及加强EPCs修复重建血管功能的发挥〔35〕。

此外，一些血液循环中的因子如SDF-1α,粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF),白细胞介素(IL)-8和裂解酶均参与动员EPCs从骨髓中迁移到外周血液中。同样，HIF-1α介导释放单核细胞趋化蛋白(MCP)-1〔36〕和红细胞生成素(EPO)〔37〕，后者与靶细胞上的基质细胞衍生因子-1受体(CXCR)-4结合从而促进EPCs的迁移、归巢和分化。

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