山羊痘病毒检测方法研究进展

张莹辉，姚文生，康 凯，王团结，薛 麒，吴思捷，赵俊杰，印春生

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

山羊痘病毒(goat pox virus，GTPV)属于痘病毒科(poxviridae)脊椎动物痘病毒亚科(poxvirinae)山羊痘病毒属(Capripoxvirus)，可感染绵羊和山羊引起恶性痘病，包括肯尼亚绵羊痘、山羊痘、印度羊皮炎、北非绵羊和山羊的石痘等，其中细毛羊、羔羊最易感山羊痘病毒。病羊呈现特征性的临床表现：发热、无毛或少毛部位皮肤黏膜发生丘疹和疱疹、淋巴结肿大、皮肤水肿、病羊消瘦、产乳量大幅度降低，严重降低了山羊的生产性能及羊毛和羊皮制品的质量，是所有动物痘病中最为严重的一种，成年发病羊死亡率可高达42.06%，病羔羊死亡率高达100%，一旦发病可造成巨大经济损失[1-3]。本病在世界许多地区已有发生，特别是非洲北部、中东和亚洲的部分国家流行较为严重，我国周边国家如尼泊尔、俄罗斯、印度等也均有流行。而我国境内的江苏、陕西、福建以及四川、云南、广西等地也有该病的发生，主要是由于养羊业发展过程中，品种的引进、流动引起了山羊痘的传播和流行。此病为OIE规定的A类疾病，我国将其列为国家I类动物疫病[4-6]。此外山羊痘病毒还可感染人，重庆市彭水县发生一例具有特异性病原学诊断依据人感染羊痘病例，其他地区还发生过几例人感染羊痘的报道，所有病例均有与病羊的接触史，为接触性感染，因此山羊痘病毒检测方法的研究具有重要的公共卫生学意义[7]。为此，就近年来山羊痘病毒检测方法研究进展进行了综述，以为其确诊提供参考。

1　病原学检测

1.1病毒的分离鉴定病毒的分离鉴定可采集发病羊皮肤和黏膜的痘疹和痘斑以及鼻腔分泌物、发热期血液和肺部病变组织、淋巴结等作为病料[8]。山羊痘病毒培养多选用原代或次代羔羊睾丸细胞或羔羊肾细胞，除这两种细胞较为敏感外，犊牛睾丸细胞也具有同样的敏感性，一些分离株也可在Vero、BHK-21及鸡胚绒毛尿囊膜细胞上生长。

刘棋等[9]使用疑似病羊的皮肤丘疹、水泡或脓疱组织的病毒悬液接种于初生羔羊睾丸细胞观察到明显的细胞病变：接种第2天大部分细胞变圆、变细，细胞浆内有可疑颗粒及空泡，感染单层细胞在5天内死亡；而接种于9～10日龄鸡胚绒毛尿囊膜，未见痘斑，传3代均无异常变化。切环[10]取内蒙古病羊的皮肤痘疹和水疱作病料样品，分别接种BHK-21传代细胞和10日龄SPF鸡胚，BHK-21细胞出现了明显的、规律的细胞病变：单层BHK-21细胞在24 h后开始收缩、聚集，于48 h后病变细胞开始拉网，出现空泡，至72 h细胞全部脱落死亡。接种病料样品的10日龄SPF鸡胚，在120 h后剖检，结果发现鸡胚胚体出血、充血，绒毛尿囊膜增厚，接种部位具有明显的痘斑。周碧君等[11]取贵州省发生的疑似山羊痘病例山羊的皮肤疱疹和水疤作病料，接种BHK-21传代细胞盲传3代后，出现了明显的、规律的细胞病变。用该BHK-21细胞培养物接种9日龄鸡胚绒毛尿囊膜，随着传代次数的增加，痘斑病变的出现率有所上升。李有文等[12]将某制药厂提供的山羊痘病毒毒株接种于经过三种不同处理的绵羊睾丸细胞，出现了不同的细胞病变，其中接种于原代绵羊睾丸细胞，在病变初期细胞圆缩或变长，中期成片成葡萄串状，后期为长梭细胞与葡萄串状交织相连；而接种于传代绵羊睾丸细胞，病变初期细胞变长，中期细胞交织拉网，后期细胞间质变大、脱落；接种于冻存的绵羊睾丸细胞，细胞在病变初期变窄、变长，中期长细胞交织拉网，后期细胞间质变大、脱落。

1.2病毒的电镜观察周碧君等[4]采集了贵州两个山羊痘疫区的病死羊病料，经过鸡胚绒毛尿囊膜细胞和BHK-21细胞培养，将培养所得材料制成切片，经硝酸铅和醋酸铅双重染色后对病毒粒子进行了观察：初期的病毒粒子呈卵圆形，大小约为250 nm～350 nm，被膜完整或不完整，被膜内所含电子密度较高而均匀的物质所占比例大，另有电子密度中等而均匀的物质分布在电子密度较高物质的四周；中期的病毒粒子形状和大小类似于初期病毒，但电子密度高的物质所占比例较小，病毒粒子直径较小，可见致密的类核体；完全成熟的病毒粒子致密，多呈卵圆形，电子密度不均匀，大小约为(150 nm～180 nm)×(220 nm～280 nm)，中央有呈哑铃形的核酸芯髓和两个功能不清的侧小体。

2　血清学检测方法

2.1病毒中和试验病毒中和试验是检测羊痘病毒特异性较强的血清学诊断方法，但羊痘感染后主要以细胞免疫为主，感染动物仅产生低水平的中和抗体，导致病毒中和试验的敏感性不高[13-14]。

2.2免疫琼脂扩散试验周碧君等[11]将盲传4代后感染BHK-21细胞培养物反复冻融3次与山羊痘标准阳性血清做琼脂扩散试验，能够出现白色沉淀线，而与正常对照细胞沉淀抗原和PBS不出现沉淀线。王开功等[15]采用琼脂扩散试验对患病山羊皮肤黏膜痘疹和感染细胞培养物进行检查，发现对于病毒粒子含量较高的病料，其阳性检出率亦较低，对感染细胞培养物也难以直接检出病毒抗原。

2.3酶联免疫吸附试验王芳等[16]将人工合成密码子优化的GPV p32基因，在大肠杆菌中进行表达，以纯化的重组p32-opti蛋白作为ELISA包被抗原，建立了间接ELISA抗体检测方法。该ELISA检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性，可用于GPV感染的流行病学调查以及疫苗接种动物的抗体水平监测。

2.4免疫荧光抗体试验刘忠伟等[8]使用异硫氰酸荧光标记兔抗羊痘IgG，并以羊痘荧光抗体检测羊痘皮肤痘疹切片和感染细胞抹片，发现了特异性黄绿色荧光。徐春志等[17]制备了山羊痘直接荧光抗体，检测感染细胞中的山羊痘病毒抗原，可检测出BHK-21感染细胞中病毒抗体原，且此荧光能够被山羊痘标准阳性血清特异性抑制，用制备的荧光抗体检测感染山羊痘病毒标准弱毒株、疫苗株及分离株的BHK-21细胞抹片，结果均为阳性，检测正常细胞为阴性。

2.5血凝试验王开功等[18]采用兔抗山羊痘病毒IgG致敏绵羊红细胞建立的反向间接血凝试验，对山羊痘病毒抗原有较高特异性和敏感性，与其它动物疾病病毒抗原不发生交叉反应。对现场采集的山羊痘待检抗原的检测结果表明其敏感性比AGP高，该反向间接血凝试剂可应用于兽医临床诊断(血清学监测与流行病学调查)也可作为山羊痘病毒分离培养的血清学检测指标，是一种灵敏、简单、快速的诊断方法。

3　分子生物学检测方法

3.1PCR检测方法PCR又叫聚合酶链式反应，是体外酶促合成特异性DNA的一种方法，它能够使目的DNA迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便等特点，可用于基因分离、克隆及核酸序列分析等研究。山羊痘病毒属于双股DNA病毒，更适于PCR检测[19]。徐春志等[17]比较了Trizol法和SDS-蛋白酶K法提取山羊痘病毒DNA后，根据山羊痘病毒P32基因设计了引物，建立了可用于山羊痘临床诊断的特异性强、可靠性好、灵敏度高的PCR方法，该方法可检测出山羊痘病毒Y株、贵州现场分离毒LD株和QL株的细胞感染物以及山羊痘疹样本中病毒DNA。张志成等[20]基于GenBank上发表的羊痘病毒全基因序列，设计合成了一对引物，建立了检测羊痘病毒的PCR方法及其试剂盒。郭巍等[19]人基于山羊痘病毒P32特异性基因和α-微管蛋白特异性基因，设计了2对引物，扩增到了P32基因与GenBank上收录序列同源性达到98%，表明了该方法具有很好的特异性和准确性。

3.2PCR-酶切检测方法冯迎春等[21]针对山羊痘病毒T3A/T3C基因设计了1对特异引物，并以其DNA为模板进行PCR扩增，连接到pMD18载体进行序列测定，其结果与已报道的山羊痘病毒相应序列进行比对，其同源性高达98%。同时利用产物中的特有酶切位点EcpR V(89位)进行进一步的酶切分析，建立了特异的PCR/酶切检测方法，结果表明该引物特异性好，敏感性强，可应用于山羊痘病毒感染的临床诊断。

3.3荧光定量PCR检测方法荧光定量PCR是20世纪90年代由美国某生物公司率先推出的一种新型的核算定量技术，相比普通PCR，它具有较强的直观性，特异性强、敏感性好、精确性高，从而被广泛用于疾病诊断、基因检测和免疫分析等领域[22-23]。张倩等[24]针对山羊痘病毒基因组P32基因设计了1对特异性引物，构建出稳定的标准品，来替代定量测定山羊痘疫苗半成品中的核酸。该标准品敏感性和特异性高、稳定性好，可用于山羊痘核酸的定量测定。实时荧光定量PCR通过在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实施监测PCR的全过程，最后建立标准曲线对模板进行定量分析[25]，是一种灵敏度高、特异性好、稳定性强的PCR方法，可广泛用于分子生物学和医学等领域的研究[26]。目前在兽医领域，RQ-PCR应用于病原体分子检测、基因表达定量分析、单核苷酸多态性及其突变分析等[27]。安维雪等[28]针对山羊痘病毒参考毒株A29L基因序列,设计了1对特异性引物以及2条TaqMan探针,同时制备重组质粒标准品，建立了羊痘病毒实时荧光定量PCR检测方法,该诊断方法与4种非羊痘病毒不发生交叉反应,其重复性试验变异系数均低于2%，具有良好的特异性,灵敏性、稳定性。姚俊等[29]针对山羊痘病毒gp063基因DNA序列，设计了1条PCR引物和1支TaqMan探针，同时制备了含有靶DNA序列的PEASY-T1重组质粒标准品，经过反应条件的优化建立了山羊痘病毒Taqman法实时荧光定量PCR检测方法，经检测该方法具有较高的灵敏性、特异性且安全、快速，适用于山羊痘病毒的早期检测。赵文华等[30]基于小反刍兽疫病毒的N基因以及山羊痘病毒的ITR基因，分别设计合成了2套特异性引物及探针，分别用5’FAM-TAMRA3’及5’JOE-Eclipse3’标记后建立了N-ITR基因的二联探针实时荧光定量RT-PCR，该方法特异性好，敏感度高，无交叉反应，且可实现两种病毒的快速同步检测。程振涛等[31]选取了位于山羊痘病毒基因组gp064区域的基因片段，设计合成了1对PCR引物和一条TapMan-MGB探针，建立了PQ-PCR和标准曲线，该检测方法可用于临床样本、人工感染动物试验组织以及三带喙库蚊体内山羊痘病毒的定量检测，特异性高、敏感性好、临床应用性强。

3.4双重PCR检测方法在PCR技术不断发展过程中，产生了多重PCR技术，能够一次性鉴别多种疾病，在疫病的诊断上有着非常大的优势[32]。向智龙等[33]基于山羊痘病毒ITR和羊口疮病毒H2L基因片段，合成两对引物，以山羊痘病毒和羊痘疮病毒的核酸混合物作为模板，建立了快速鉴别检测两种病毒的双重PCR方法，该方法特异性强、敏感性高、快速简便，可用于山羊痘病毒和羊口疮病毒的联合检测和鉴别诊断。肖雯等[34]针对绵羊痘病毒(SPPV)和山羊痘病毒的基因组序列，分别设计了2对特异性引物，经优化条件，建立了快速鉴别检测SPPV和GTPV的双重PCR方法，该方法特异性试验中，未对牛疙瘩皮肤病病毒、犬细小病毒、大肠杆菌O157、沙门氏菌等有特异性扩增，同时具有较好的灵敏度。

4　存在的问题与展望

综上所述，要防治山羊痘的发生和流行，其早期的诊断非常重要。在山羊痘病毒的检测中，琼脂扩散实验操作简便，但其敏感性不高。ELISA方法具有较高的灵敏性和特异性，是世界卫生组织推荐的诊断方法之一。近年来我国学者研究的侧重点主要是PCR方法，此方法多基于P32基因、ITR基因、A29L基因、末端反向重复序列等设计引物，具有灵敏度高、特异性好、快速等优点，其中以荧光定量PCR方法最好，可作为实验室诊断的有效方法。但是鉴于此方法对仪器设备、实验操作人员以及实验的条件等均由有较高的要求，在检测成本有限的情况下推广此方法有较高的难度。

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