五氯柳胺的残留与临床应用研究进展

白玉彬，邵莉萍，董 朕，张继瑜

(中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，农业部兽药创制重点实验室，兰州 730050)

五氯柳胺(Oxyclozanide) 属于水杨苯酰胺类药物，别名氯羟柳胺、羟氯柳苯胺、羟氯扎胺等，是一种氧化磷酸化解偶联剂，可降低寄生虫体内三磷酸腺甙(ATP)的合成量，从而导致虫体因能量代谢紊乱而最终死亡。五氯柳胺不仅对牛、羊肝片吸虫有较好的驱虫效果，而且对绦虫、线虫也有活性，是一种广谱、低毒、低残留的化学合成药物。作为治疗肝片吸虫病的主要药物之一，五氯柳胺在国外得到了广泛的应用，但在我国还没有相关产品上市。开展五氯柳胺的残留检测研究，对于五氯柳胺的新药研发、应用以及食品安全控制具有重要的意义。

1　五氯柳胺的应用现状

肝片吸虫病是一种世界性的疾病，在尼日利亚、巴基斯坦、中国、美国、伊朗等国家均有报道[1]。在澳大利亚每年有大约四千万的羊和六百万的牛感染肝片吸虫[2]，仅仅养牛产业每年肝片吸虫病的防治费用就高达2500万美元[3]。在孟加拉国，肝片吸虫病作为最主要的寄生虫病，黄牛的发病率为60%，水牛的发病率为99.99%，山羊为12.29%，绵羊为8.34%，每年给孟加拉国造成约5411万孟加拉塔卡的损失。在埃及，粪便检查估计肝片吸虫病流行率为12.70%[4]。El-Shazly等报道肝片吸虫对于牛、水牛、羊、山羊的感染率分别为12.31%、9.73%、17.84%、5.40%[5]。全世界每年因肝片吸虫所导致的损失超过32亿美元。除此之外，肝片吸虫还被认为是新兴的人类疾病。在2006年，世界卫生组织评估240万人感染肝片吸虫，1.8亿人处于被感染的风险中[6]。肝片吸虫病给畜牧业的发展以及人类健康带来了严重的影响，五氯柳胺作为治疗肝片吸虫病的主要药物之一，具有良好的效果。Rolfe和Boray报道，以18.7 mg/kg.bw剂量给药，在治疗牛成熟和未成熟吸虫方面，有效率可达到99%～100%[7]。Walley报道，以10 mg/kg.bw剂量给药，在治疗羊成年吸虫方面，有效率为71%～85%，以15 mg/kg.bw剂量给药，有效率为91%～97%，以20 mg/kg.bw剂量给药，有效率可达到95%；以10 mg/kg.bw剂量给药，在治疗牛成年吸虫方面，有效率为80%，以15 mg/kg.bw剂量给药，有效率可达到92%[8]。至今为止，国外已上市的产品有五氯柳胺片剂OKZAN-F、口服混悬剂ZANIL Fluke Drench (34 mg/mL Oral Suspension)以及复方制剂左旋咪唑和五氯柳胺复方片剂、五氯柳胺(3%W/V)、左旋咪唑(1.5%W/V)复方混悬剂等[9]。五氯柳胺毒性低、残留少且未见产生耐药性的报道，作为治疗肝片吸虫病的主要药物之一，其具有良好的市场应用前景。

2　五氯柳胺的临床药效学

国内外对五氯柳胺防治牛、羊等动物寄生虫病的研究试验有广泛的报道，研究证明五氯柳胺不仅对治疗肝片吸虫具有良好的疗效，而且还可以用于治疗蛔虫和绦虫感染。

蔡登棣报道，用五氯柳胺治疗黄牛肝片吸虫感染，以30 mg/kg.bw剂量给药，一周后剖检，胆管中发现虫体崩解物，无成活虫体。分别以12 mg/kg.bw和20 mg/kg.bw剂量治疗绵羊肝片吸虫感染，12 mg/kg.bw组胆管中发现死虫体20条，活虫6条，而20 mg/kg.bw组胆管中无成活成虫，且发现有死亡的童虫[10]。可见，五氯柳胺不仅对成虫具有杀灭效果，同时对于童虫也同样有效。

Paraud等用五氯柳胺治疗山羊杯殖多布尼吸虫(Calicophoron daubney)感染，在感染后第10天，用22.5 mg/kg.bw剂量的五氯柳胺治疗，虫体减少率82%。在蠕虫感染131 d之后，分别以15 mg/kg.bw和22.5 mg/kg.bw剂量的五氯柳胺进行治疗，蠕虫减少率分别达到95.6%和95.9%[11]。由此可见五氯柳胺对于治疗山羊杯殖多布尼吸虫感染是非常有效的。

Mooney等采用多种抗寄生虫药在治疗肝片吸虫感染羊的对比试验中，在第0天，分别给以三氯苯达唑、氯氰碘柳胺、五氯柳胺和硝碘酚腈，在感染后7、14、21、56 d分别收集粪便样品。在治疗后第56天，由于耐药性的产生，三氯苯达唑组粪便中虫卵减少量明显低于90%，而在治疗后第14天，氯氰碘柳胺组、五氯柳胺组和硝碘酚腈组粪便中虫卵数减少100%[12]。说明五氯柳胺对于治疗肝片吸虫具有良好的疗效。

Athar等报道，使用五氯柳胺治疗肝片吸虫、大片吸虫等寄生虫感染，给药14 d后，粪便中的寄生虫数量明显减少，水牛的治愈率达到96.66%，肉牛的治愈率达到95.64%，日产奶量分别增加0.89、0.71 L，脂肪率分别增加0.42%和0.37%[13]。从而可以推断出单一剂量的五氯柳胺对治疗牛肝片吸虫病有效。

Arias等在治疗牛自然感染杯殖达布尼吸虫中，分别采用阿苯达唑、奈托比胺、氯氰碘柳胺、五氯柳胺四种药物进行对比治疗。用10 mg/kg.bw剂量的阿苯达唑或用20 mg/kg.bw剂量的奈托比胺治疗之后，粪便中虫卵数减少0～26%，且经过治疗之后有11%～39%的牛精神表现沉郁。而以15 mg/kg.bw剂量五氯柳胺或者10 mg/kg.bw剂量的氯氰碘柳胺治疗后，粪便中虫卵数减少97%～99%[14]。

Rodrigo Sanabria等用五氯柳胺治疗前后盘吸虫自然感染绵羊，实验组在第0天口服20 mg/kg.bw剂量的五氯柳胺，72 h时第二次给药，对照组不给药，在第0天、3天、5天采集粪便样品。第5天时粪便中虫卵减少率99.5%，同时用高效液相色谱法对血清及胃肠道中五氯柳胺浓度进行检测，测得血清中五氯柳胺浓度最高为20.7±11.5 μg/mL，小肠液中浓度为6.00±4.50 μg/mL。在瘤胃和腹腔液中测得的五氯柳胺浓度非常低，分别为0.05、0.02 μg/mL[15]。研究表明口服五氯柳胺对成熟的前后盘吸虫有很好的治疗效果。

EMEA等报道，以15 mg/kg.bw剂量的五氯柳胺单次给药时，对牛的中枢神经系统以及肠道结构有不良的影响，表现为精神沉郁、腹泻和厌食，当剂量大于50 mg/kg时，出现动物死亡。而以20 mg/kg.bw剂量的五氯柳胺给药时，绵羊未表现出明显的不良反应[16]。在动物吸虫病的药物防治中，由于三氯苯达唑、阿苯达唑、氯氰碘柳胺和硝碘酚腈等化学治疗药长期使用，寄生虫均产生了抗药性[17-19]，至今为止，对于五氯柳胺的耐药性国内外还未见报道。

3　五氯柳胺的残留检测研究进展

3.1最高残留限量(MRL)欧洲药品管理局、澳大利亚以及食品法典委员会均制订了牛羊组织中五氯柳胺的最大残留限量，限量值分别为肌肉20 μg/kg、脂肪20 μg/kg、肝500 μg/kg、肾100 μg/kg。欧盟规定五氯柳胺在牛奶中的最高残留限量为10 μg/kg。我国目前还未有相关的药物上市，所以我国农业部对五氯柳胺的最高残留限量未作出明确规定。

3.2休药期关于五氯柳胺休药期的相关报道相对较少，Ali and Bogan等研究表明，将五氯柳胺以15 mg/kg.bw剂量口服给药，测得其在羊血浆中半衰期为6.4 d[20]。Fujinuma等报道了将五氯柳胺以10 mg/kg.bw剂量给奶牛口服给药，测得其在血浆中的半衰期为7.4 d，检测限为2 μg/kg；在奶中的 半衰期为30～47 h，检测限为1 μg/kg[21]。欧盟规定，五氯柳胺在牛、羊肉和内脏中的休药期均为 28 d。

3.3五氯柳胺的残留检测方法

3.3.1高效液相色谱法Kyul Jo和 Hee-Jung Cho等建立了牛肉及牛奶中五氯柳胺的残留检测的高效液相色谱法，以乙腈和0.1%磷酸(4∶6)为流动相，出峰时间为8.3 min，定量限9.7～9.8 μg/kg，回收率为(70.70±7.90)%～(110.79±14.95)%[22]。

王伟等采用高效液相测定牛羊奶中五氯柳胺、硝碘酚腈、氯氰碘柳胺、碘醚柳胺的残留量，建立的标准曲线在5～500 μg/kg范围内呈现良好的线性关系，相关系数>0.99，检测限为3 μg/kg，定量限为5 μg/kg，五氯柳胺在1/2最高残留限量(MRL)、1倍MRL、2倍MRL添加水平下的平均回收率和相对标准偏差分别是87.40%～94.74%和5.40%～12.21%[23]。

Rodrigo Sanabria等使用高效液相色谱法对血浆及胃肠组织中五氯柳胺的残留量进行了检测，以100%乙腈(40%，A液)和0.025 mol/L乙酸胺 (pH=8.5，60%，B液)作为流动相，使用紫外检测器在254 nm下进行检测，测得保留时间为4.7 min，定量限为0.1 μg/mL，在0.1～40 μg/mL范围内，平均绝对回收率为75%～86%[15]。

3.3.2液相色谱-串联质谱法Whelan等采用超高效液相色谱-串联质谱法测定牛奶及奶酪中五氯柳胺的残留量，以0.01%的乙酸水∶乙腈(9∶1)(A液)和5 mmol/L甲酸铵甲醇溶液∶乙腈(75∶25)(B液)作为流动相进行梯度洗脱，测得五氯柳胺的保留时间为6.83 min，在给药后第三次(即第2天)采样时测得五氯柳胺最高残留浓度范围为8～24 μg/kg，在给药后第13次(即第七天)采样后，测得残留量小于1 μg/kg，低于最高残留限量[24]。

李帅鹏等采用高效液相色谱-串联质谱法研究牛、羊组织中硝碘酚腈、五氯柳胺、氯氰碘柳胺、碘醚柳胺4种苯酚类和水杨酸苯胺类抗蠕虫药的多残留检测方法，在1～100 μg/kg 范围内呈现良好的线性关系，相关系数大于0.99。在牛、羊组织中的检测限为1 μg/kg，定量限为2.5 μg/kg。在LOQ、0.5倍最高残留限量(MRL)、1倍MRL、2倍MRL添加水平下，平均回收率为71%～112%，日内相对标准偏差(RSD) 为1.1%～14.0%，日间RSD为6.4%～14.7%[25]。

已报道的五氯柳胺的残留检测研究表明，各种检测方法均具有良好的线性关系，且回收率范围均符合相关规定，可以满足临床对五氯柳胺残留检测的需要。王伟等[23]所采用的测定牛羊奶中五氯柳胺残留的液相方法，其平均回收率为87.40%～94.74%，与Kyul Jo和Hee-Jung Cho等建立的牛肉及牛奶中五氯柳胺残留检测的高效液相色谱法的回收率(70.70±7.90)%～(110.79±14.95)%[22]、Rodrigo Sanabria等所采用的测定组织样品中五氯柳胺残留的液相方法的回收率75%～86%[15]、李帅鹏等采用高效液相色谱-串联质谱法研究牛、羊组织中硝碘酚腈、五氯柳胺、氯氰碘柳胺、碘醚柳胺4种苯酚类和水杨酸苯胺类抗蠕虫药的多残留检测方法的回收率71%～112%[25]相比，其回收率更高，且方法稳定性更好；其检测限为3 μg/kg，定量限为5 μg/kg，相比于其他方法较低。而Rodrigo Sanabria等所采用的测定组织样品中五氯柳胺的残留的液相方法，其定量限仅为0.1 μg/mL[15]，相比于其他方法更低。

4　展　望

五氯柳胺作为一种化学合成类抗寄生虫药物，具有高效、安全的特点，五氯柳胺不仅对于治疗肝片吸虫病具有良好的效果，而且对线虫和绦虫效果显著。对于牛来说，以10 mg/kg.bw剂量给药，对于治疗牛的大部分肝片吸虫以及绦虫的有效率可达到90%以上，同时可以促进产奶率以及脂肪率的增加，因此，建议以10 mg/kg.bw剂量给药较宜；对于羊来说，以20 mg/kg.bw剂量给药，羊胆管中无成活肝片吸虫成虫，在治疗五天之后其粪便中虫卵减少率可达到99.5%，因此，建议以20 mg/kg.bw剂量给药较宜。随着一些抗寄生虫药物的长期大量使用，寄生虫病得到了有效的控制，与此同时，耐药性的产生，也成为临床用药的重要障碍，20世纪90年代便有关于三氯苯达唑、氯氰碘柳胺耐药性的相关报道，而五氯柳胺至今未出现耐药性的相关报道，并且凭借其显著的疗效在国外得以广泛应用。五氯柳胺作为治疗动物肝片吸虫病的主要药物，其在国外得到了广泛的使用，已有片剂、口服混悬剂、复方片剂、复方混悬剂等多种产品上市，而在国内还没有相关的产品上市。目前所报道的多种五氯柳胺残留的检测研究表明，各种检测方法均具有良好的线性关系，回收率范围均符合相关规定，其样品处理方法完全可行，可以满足五氯柳胺残留检测的需要。

随着我国草食畜牧业的发展，牛羊饲养量的正在迅速增长，兽药的使用给养殖业带来高效益的同时，由于兽药使用量的大幅度增加，导致动物性食品兽药残留超标，直接危害人体健康。目前，我国有50%以上的牛患有肝片吸虫病，随着三氯苯达唑、氯氰碘柳胺等药物耐药性的产生，临床药效不断下降，五氯柳胺作为治疗肝片吸虫病最好的药物之一，开发和研制一种或几种五氯柳胺的制剂不仅可以有效防治肝片吸虫病，给人类带来巨大的经济利益，而且可以促进我国畜牧业的良性发展，但药物的使用必定会带来药物残留问题，本文对五氯柳胺的临床药效学和残留检测方法进行了综述，以期为五氯柳胺的临床应用以及残留检测研究和监测提供指导。

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