动物营养素对猪肠黏膜免疫影响的研究进展

武晋孝， 李清宏

（1.山西省饲料兽药监察所，山西太原 030027；2.山西农业大学，山西太谷 030800）

1 猪肠黏膜免疫机制

肠道黏膜免疫是一种高度特异性的免疫系统，由肠道淋巴样组织（GALT）及其分泌的免疫球蛋白和免疫细胞因子组成，其以分泌型IgA（sIgA）介导的体液免疫为主，细胞毒性介导的细胞免疫为辅。组织化淋巴组织由派伊氏结、肠系膜淋巴结以及孤立淋巴滤泡组成，是肠黏膜免疫的诱导位点和活化位点，主要负责抗原的摄取和转运。其中，派伊氏结是肠道免疫的主要诱导部位。弥散分布的淋巴组织包括肠黏膜固有层淋巴细胞和肠上皮内淋巴细胞，是肠黏膜免疫系统的效应位点（高玉云等，2015），在此摄取和转运来的抗原被激活而产生免疫球蛋白和各种免疫因子。其中，黏膜固有层淋巴细胞 （主要为B细胞和CD4+T细胞）以分泌Th-2型细胞因子和IgA为主 （Husband等，1996）；上皮内淋巴细胞（主要为CD8+T细胞）主要发挥细胞毒性作用并高水平表达Th-1型细胞因子（IL-2、IFN-γ）（周金星等，2006）。

1.1 肠黏膜免疫系统对抗原的摄取、处理和递呈肠道内的派伊氏结（PP）分布于肠系膜缘对侧肠壁黏膜下，由多个淋巴滤泡聚集成高度器官化的黏膜相关淋巴组织，在结构上分为3个区：圆顶区、具有生发中心的淋巴小结区（主要为IgA+B细胞）和T细胞依赖区（主要为CD4+T细胞）。PP的一个重要特征就是覆盖在派伊氏结圆顶区上的滤泡相关上皮 （FAE）中有一种特殊的抗原捕捉细胞——微皱褶细胞（M细胞）。M细胞的主要功能是作为抗原物质进入黏膜组织的通道，摄取并转运抗原，尤其是转运颗粒性抗原至位于其下方的淋巴组织（Luz等，2006）。但研究发现M细胞并不表达MHC-Ⅱ类分子，而此类分子对于T细胞与APC之间的相互作用必不可少，因此M细胞主要是以胞吞的方式非特异性的摄取和转运抗原。而在派伊氏结的圆顶区内，存在富含MHC-Ⅱ分子的巨噬细胞、树突状细胞和B细胞，这些细胞承担了处理和呈递抗原的任务 （杨汉春，2003）。M细胞摄取的抗原以囊泡形式转运给抗原呈递细胞，再经其加工处理之后呈递给TH细胞，TH分泌细胞因子可刺激B细胞的增殖分化以及种类转换，并最终分化形成致敏的IgA+B细胞。

1.2 淋巴细胞归巢 诱导位点和效应位点主要是通过淋巴细胞归巢联系在一起。即在诱导位点致敏的免疫淋巴细胞，通过胸导管进入血循环，逐步分化成熟，并在淋巴细胞表面归巢受体的介导下，大部分致敏淋巴细胞归巢到效应位点（即黏膜固有层、上皮内），并逐步分化为成熟的效应淋巴细胞进而发挥免疫效应 （王健理等，2010），少部分未致敏的淋巴细胞继续归巢至派伊氏结进行再循环（杨建军，2006）。效应位点中还有多种T细胞亚型，表现出辅助、调节和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）等活性，以完成和调节黏膜表面保护性的免疫反应。例如上皮内淋巴细胞具有溶细胞活性，能够杀死和清除病毒感染或损伤的上皮细胞；还具有辅助功能，可产生Th-l、Th-2功能相关的细胞因子，调节其他淋巴细胞和上皮细胞功能（李恒鑫，2005）。

1.3 免疫应答过程中的效应因子 sIgA是黏膜免疫应答过程中的主要效应因子，是阻止病原体入侵黏膜的第一道有效防线。派伊氏结中经抗原刺激产生的致敏IgA+B细胞经黏膜下胸导管进入血液循环，并经分化增殖到达黏膜固有层，成为成熟IgA浆细胞。二聚体IgA在浆细胞的胞浆内合成并释放到浆细胞外侧，再与上皮细胞内表面的分泌成分（SC）结合，并通过SC转运到上皮细胞外表面形成sIgA，最后释放到肠腔中（刘文倩等，2009）。分泌入肠腔的sIgA能选择性的黏附于M细胞的顶面，这进一步增加了M细胞摄取抗原的能力。sIgA是相对非炎性物质，其功能可以概括为：（1）中和毒素、病毒或者其他生物活性抗原；（2）阻抑黏附。微生物必须黏附于组织细胞上才有可能引发感染，sIgA可使病原微生物发生凝集，丧失活动能力而不能黏附于黏膜上皮细胞；（3）溶解细菌。sIgA无直接杀菌作用，但能与补体和溶菌酶协同抗菌。

细胞因子包括淋巴因子、单核因子、白细胞介素（IL）、干扰素（IFN）、肿瘤坏死因子（TNF）、集落刺激因子（CSF）和生长因子（GF）等（胡迎利等，2005）。激活的肠黏膜免疫细胞（T细胞、B细胞、NK细胞等）和肠上皮细胞是肠黏膜免疫过程中细胞因子的主要来源。按细胞因子在炎症反应中的作用，可以将其分为促炎细胞因子和抗炎细胞因子两大类（吴泽生等，2012）。机体通过调节肠道内促炎细胞因子和抗炎细胞因子的平衡来调节免疫反应。此外，肠道上皮内淋巴细胞产生的Th-l、Th-2型细胞因子能够调节肠道淋巴细胞的分化和刺激上皮细胞更新，维护肠道屏障的完整性（宫德正等，2002）。

2 动物营养素对猪肠黏膜免疫影响的研究进展

肠道所消耗的养分占动物采食养分的40%～60%，其氧气消耗占机体消耗量的20%～35%，能量消耗占机体消耗的25%，肠道组织蛋白质周转率占全身周转率的20%～35%（陈代文等，2012）。在养分缺乏、病理状态下，肠道黏膜组织会出现结构损伤、功能失调，具体表现为肠道通透性增强，肠道屏障功能障碍，外源性抗原物质侵入体内，出现各种肠道疾病。因此，养分在维持肠道黏膜的正常生长及肠道屏障功能方面发挥着重要作用。

2.1 蛋白质、氨基酸及其衍生物 近年来的研究表明，功能性氨基酸及其衍生物的应用在维护猪肠道结构的完整、提高肠黏膜免疫方面有重要作用。

喷雾干燥血浆蛋白粉（SDAP）对肠道和血液的影响程度不同，起作用的主要部位在肠道（高玉云等，2011）。据报道，连续18 d在新生仔猪日粮中添加10%SDAP发现，与10%鱼粉对照组相比，仔猪肠黏膜 TNF-α、IL-6、IL-1β、转化因子 β（TGF-β）和可溶性IL-2受体蛋白含量显著减少（Gao等，2011）。此外，SDAP能够减少断奶仔猪肠道 TNF-α、IL-8、INF-γ 促炎细胞因子 mRNA 的表达量，表明SDAP可降低由肠毒性大肠杆菌诱导的肠道促炎细胞因子的表达（Bosi等，2004）。此外，有报道称，SDAP可以降低肠道黏膜MDA的含量，改善肠道的抗氧化能力。综合各项研究发现，SDAP可通过降低肠道黏膜促炎细胞因子以及在氧化应激的条件下提高肠道抗氧化水平这两种途径来维持肠道黏膜屏障的完整性。

精氨酸是合成NO、多胺和谷氨酰胺等重要分子的一种重要前提物。猪的肠道上皮细胞可以合成精氨酸，对维持仔猪体内精氨酸的动态平衡起着重要的作用。日粮中添加精氨酸能够维持肠道免疫屏障的完整性 （刘建新，2012）。毛湘冰等（2012）报道，适当浓度的L-精氨酸可以显著提高猪小肠上皮细胞系IPEC-J2细胞内β-防御素1、2和3 mRNA和蛋白质水平的表达量，且添加水平达到100 μg/mL时，表达量均到达最大值。防御素是一类可杀死细菌、真菌或者病毒等微生物并有抗肿瘤活性的多肽，是机体抵御外源性致病因子的重要屏障。其能有效杀灭革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌，而且还能够作为一种效应分子激活巨噬细胞、DC、肠上皮细胞等细胞表面受体从而启动获得性免疫系统。黄琳等（2012）报道，添加精氨酸可显著降低体外氧化应激猪肠上皮细胞中 IL-1β、IL-2、NF-κB、JNK 含量， 增加细胞中IL-4、精氨酸和NO含量。在L-精氨酸对脂多糖刺激断奶仔猪肠黏膜免疫屏障的影响试验中，朱慧玲等（2012）发现，LPS刺激降低了回肠IgA分泌细胞、CD4+、CD8+阳性细胞数，而0.5%的精氨酸增加了IgA分泌细胞、CD4+、CD8+阳性细胞数，其中CD4+细胞可促进黏膜固有层浆细胞合成sIgA。肠壁细胞分泌的IgA是黏膜应答过程中的主要效应因子，也是阻止病原体入侵黏膜的重要防线。这表明日粮中添加精氨酸可有效改善肠黏膜免疫屏障功能。研究表明，精氨酸调控肠道发育，维持肠道黏膜屏障的完整性主要是通过其代谢产物（NO、多胺、谷氨酰胺）来分析的，对精氨酸如何通过免疫效应因子来维持肠道黏膜免疫屏障的研究较少，其作用机理还有待进一步的研究。

N-乙酰半胱氨酸（NAC）生物利用率高，进入细胞脱去乙酰基成为谷胱甘肽的合成前体。谷胱甘肽可参与调解细胞增生和机体免疫应答，也能够抑制氧化应激引起的急性和慢性炎症反应。在研究不同水平N-乙酰半胱氨酸（NAC）对脂多糖（LPS）单次刺激仔猪肠黏膜免疫应激的试验中，日粮中添加250 mg/kg和500 mg/kg NAC可有效抑制LPS刺激导致的肠黏膜中促炎细胞因子的升高，缓解急性免疫应激（伍国华，2012）。同样，杨震国等（2011）的研究也发现，日粮中添加500 mg/kg NAC可有效抑制LPS刺激导致的血浆及小肠黏膜中促炎细胞因子的升高，缓解免疫应激。

2.2 锌 小肠是吸收锌的主要器官，其吸收的主要部位是十二指肠和空肠。锌可通过小肠内壁上皮细胞的刷状缘从肠腔摄取。缺锌可引起肠道黏液分泌细胞的超微结构损害，使得黏液蛋白的合成和分泌受阻，黏液稠度降低，削弱了肠黏膜免疫力（李恒鑫，2005）。不同蛋白质水平日粮中添加高锌能够抑制炎症细胞因子的分泌，促进肠道黏膜sIgA 的分泌，增强仔猪的免疫力（Bosi，2004）。 刘军等（2010）在研究日粮锌与蛋白质水平对断奶仔猪前炎症细胞因子和肠道黏膜免疫分子的影响时发现，锌和蛋白质水平能极显著增加空肠和回肠黏膜sIgA含量，互作效应极显著。同样，岳双明（2008）报道，不同蛋白质水平日粮中添加高剂量氧化锌可保护肠道黏膜形态，增加绒毛长度，降低隐窝深度；促进sIgA的分泌，增加肠黏膜IL-2浓度，维持Thl／Th2系统平衡，增强肠道黏膜免疫且高锌日粮效果显著优于低锌日粮。孙国军（2009）在锌和脂多糖对小肠上皮细胞（IPEC-J2）免疫功能的影响试验中发现，培养液中不同的锌水平对细胞IL-8、TNF-α和TGF-β的基因表达水平并没有影响，而经LPS刺激后，增加了IL-8和TNF-α的mRNA表达水平，降低了 TGF-β的mRNA表达水平；且与对照组 （普通培养基，6μmol/L锌）相比，随着锌浓度的提高，IL-8、TNF-α和TGF-β基因表达量均呈现增加趋势。表明经LPS刺激所产生的免疫应激会促进小肠细胞炎症反应，且随着锌浓度的增加，小肠上皮细胞的促炎性因子的基因表达呈现增长趋势，炎症反应加重。这可能是因为小肠上皮细胞对LPS具有较强的低反应性，激活了细胞免疫系统，而锌对IL-2、IL-6、TNF-α等细胞因子具有诱生作用所导致的。

2.3 维生素 廖波（2011）在日粮中添加25-OHD3对轮状病毒攻毒和脂多糖免疫应激下断奶仔猪生长性能、肠道免疫功能和免疫应答的影响和作用机理的研究中发现，日粮中添加2200 IU/kg的25-OH-D3可促进断奶仔猪肠道黏膜T细胞分化成熟，提高辅助T细胞介导的免疫反应、抑制细胞毒性T细胞参与的免疫应答，抑制Th-l型辅助细胞参与的促炎症反应、促进Th-2型辅助细胞参与的抗炎症反应。Th-1和Th-2细胞主要可通过其产生的细胞因子发挥作用。Th-1型细胞因子可参与细胞介导的免疫应答；Th-2型细胞因子可通过辅助B淋巴细胞产生抗体，参与抗体介导的体液免疫应答。25-OH-D3可以增强Th-2型免疫反应，促进sIgA的分泌，而sIgA可以有效中和病毒，从而提高断奶仔猪抵抗肠道疾病的能力。

2.4 牛膝多糖 日粮中添加牛膝多糖能够增加猪肠道黏膜sIgA的分泌，增强肠道免疫功能。据报道，一次性腹膜注射80 μg/mL体重大肠杆菌脂多糖（LPS）显著导致断奶仔猪3 h回肠黏膜免疫屏障受损，24 h后免疫受损得以缓解，饲料中添加0.1%牛膝多糖（ABP）能增强仔猪回肠黏膜免疫功能，缓解LPS导致的回肠黏膜免疫屏障受损（印遇龙等，2012）。秦文雅（2012）研究表明，LPS 刺激 3 h 后仔猪肠道黏膜sIgA浓度极显著降低，饲料中添加ABP能极显著提高回肠黏膜sIgA浓度，但两者互作不显著。曾炯等（2012）向断奶公仔猪饲喂添加0.05%牛膝多糖日粮，与饲喂基础日粮相比，小肠黏液sIgA的含量显著提高，十二指肠上皮内淋巴细胞的数量显著提高，表明日粮中添加牛膝多糖可以促进断奶仔猪的肠道黏膜免疫。

2.5 益生菌 肠道益生菌群与动物机体形成相互依赖、相互制约的微生态平衡系统，主要体现在其可抑制肠道病原菌、调节肠道黏膜免疫这两个方面。在观察屎肠球菌EF1对断奶仔猪小肠黏膜屏障功能影响的试验中发现，与对照组相比，益生菌组的空肠黏膜sIgA分泌量提高29.90%，回肠黏膜TNF-α和空肠黏膜IFN-γ含量分别减少56.62%，而空肠和回肠黏膜IL-10含量以及空肠黏膜 TGF-β1含量分别增加 56.65%、21.83%、208.02%（黄怡等，2012）。在研究枯草芽孢杆菌对仔猪小肠局部天然免疫的试验中，分别于仔猪0、7、14、26日龄灌喂枯草芽孢杆菌（活菌数为1×108cfu/mL）。结果显示，枯草芽孢杆菌能够显著提高仔猪小肠IgA分泌细胞的数量（李云峰等，2011）。由此可知，益生菌群能够有效刺激肠道分泌sIgA，而肠道内的sIgA能够选择性的包被革兰氏阴性菌，形成抗原抗体复合物，阻碍细菌与肠上皮细胞受体结合，刺激肠道黏膜黏液分泌并加速黏液层的流动，有效阻止细菌对肠的黏附。sIgA阻抑黏附的机制可能与其可使病原微生物发生凝聚、丧失活动能力而不能和肠上皮结合，或与病原微生物结合后，阻断了病原微生物表面的特异结合位点，因而丧失黏附能力有关。因此益生菌能够加强肠道黏膜免疫功能，维护肠道黏膜屏障的完整性。

2.6 中草药添加剂 在中草药对热应激猪肠道黏膜免疫机能的动态影响机制的研究试验中，在40℃高温环境中，中草药方I（藿香、苍术、黄柏、石膏按 1∶1∶1∶1）和 II（藿香、苍术、黄柏、石膏按 1∶1∶1∶0.5）均能调整热应激下猪空肠组织中TL-2和IL-10分泌紊乱恢复，并能调整和维持空肠黏液sIgA含量，对维护热应激下猪肠道黏膜免疫具有重要意义（王自力等，2007）。

3 小结

分子生物学技术和方法在猪营养免疫研究中的应用越来越受到重视，使得猪免疫营养的研究进入到细胞分子阶段，其研究深度逐步提升。肠道细胞能够产生多种细胞因子，在肠黏膜免疫、炎症中发挥着多重而严密的调节作用，另外，细胞因子之间以网络形式存在，并与肠黏膜的黏液蛋白（主要指sIgA）共同发挥免疫调节作用，使得黏膜免疫、炎症调节机制极为复杂。从动物营养和饲料科学的角度，探讨猪肠道黏膜免疫系统和其调控营养因子，为研究胃肠道黏膜免疫的营养物质和作用机理奠定基础，为维持猪最佳免疫状态的肠道黏膜营养物质需要量的研究提供理论依据。但目前对营养素调控黏膜免疫作用机理的研究不够深入和系统，还没有一套反映肠黏膜免疫的特异性指标。建立肠黏膜免疫特异性指标体系，研究营养素与黏膜免疫（效应因子），黏膜免疫与系统免疫之间的关系等将是未来研究的热点。

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