不同饲料添加剂对肉羊瘤胃液体外发酵及甲烷排放量的影响

（吉林省农业科学院，吉林长春 130033）

目前，我国畜牧业正由粗放型向集约化转变的过程中，尤其是肉羊养殖业正经历重大的饲养管理方式变革，对精细化和生态化饲养管理技术的需求十分迫切，加之我国对环境保护越来越重视，已经成为我国的基本国策。通过营养调控技术实现肉羊养殖的低碳生产，不仅符合我国国民经济和现代畜牧业发展的方向，而且契合我国现阶段肉羊养殖产业发展的技术需求。甲烷是一种生物源性温室气体，其温室效应是二氧化碳的23倍。反刍动物瘤胃内产生的甲烷是农业生产中最主要的温室气体来源，成为影响气候变化的重要影响因素，不但造成饲料资源的巨大浪费，还对生态环境造成了严重的威胁[1-3]。因此，反刍家畜甲烷代谢调控已成为畜牧领域研究的热点之一，具有环境和经济的双重效应。

反刍动物瘤胃中产生的甲烷主要来源于日粮中碳水化合物（CHO）的降解过程。日粮中的有机物在瘤胃中被微生物分解，产生氢气（H2）和含有甲基的初级发酵产物（如甲酸、甲胺、甲醇和乙酸等），产甲烷菌可以将这些初级发酵产物转化为甲烷，并以此获得生命活动所需的能量。H2还原CO2是瘤胃中甲烷产生的主要途径，而甲酸是仅次于H2和CO2的甲烷生成底物。瘤胃中产生甲烷的生化反应机制有CO2-H2还原途径、甲酸、乙酸和丁酸等挥发性脂肪酸（VFA）分解途径以及甲醇等甲基化合物分解途径，其中CO2-H2还原途径是瘤胃中甲烷产生的主要来源，所产甲烷占反刍动物甲烷总产量的80%以上。反刍动物甲烷排放量主要受日粮组成的影响，与纤维含量密切相关，当日粮中纤维含量增加时，刺激纤维素分解菌增殖，瘤胃主要进行乙酸发酵，产生大量H2，从而促进产甲烷菌大量增殖，导致甲烷产量增加。瘤胃内甲烷的产生同时受到日粮中氮源的影响。瘤胃微生物蛋白质合成需要日粮提供所需的碳源和氮源，满足对两者的需要，才能达到微生物的最佳产量。目前，国际上反刍动物甲烷减排的营养调控措施包括：日粮组成调控、生物学调控、电子传递调控、植物提取物调控等几种主流调控方式，其中除日粮组成调控外其余措施均可通过在日粮中使用不同类型的添加剂从而达到减低甲烷排放量提高瘤胃发酵功能的目的[4、5、6]。本试验以羊草作为试验动物主要饲料原料，采用吉林省农业科学院自主研发 “六通路瞬时发酵微量产气全自动记录装置与软件系统”，对五种饲料添加剂对甲烷作用效果和瘤胃发酵功能进行对比，以期获得适宜在肉羊生产中应用推广的甲烷抑制剂。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验所用羊草采自吉林省农业科学院畜牧科学分院肉羊养殖现场，营养成分如下：干物质88.31%、粗蛋白9.89%，中性洗涤纤维30.87%，粗脂肪2.76%，粗灰分4.81%，能量19.12kJ/g。莫能菌素纯度99%，规格2000万单位；活性炭，黑色颗粒状，粉碎后用40目筛网过滤；绿茶提取物（纯度90%，茶多酚20%-98%）；酵素，枯草芽孢杆菌（≥3*108cfu/ml）、酿酒酵母菌（≥2*108cfu/ml）植物乳杆菌克（≥2*108cfu/ml）；硝酸钠（纯度99%，分析纯）。

1.2 供试动物及瘤胃液的采集

在吉林省农业科学院畜牧科学分院选用3头装有永久性瘤胃瘘管的东北肉羊为试验动物。试验羊以羊草作为唯一饲料来源，取瘤胃液前预饲期7d，每天饲喂2次（6：00和18：00），自由饮水。于每日晨饲后两小时（8：00）抽取瘤胃液，混合后装于保温瓶中带回实验室，用4层纱布过滤，同时通入氮气。试验过程中发酵装置始终保持39±0.1℃，缓冲液pH值6.8。

1.3 体外发酵

体外发酵装置采用吉林农业科学院畜牧科学分院自主研制的“六通路瞬时发酵微量产气全自动记录装置与软件系统”（图1）。称1.5g羊草作为发酵底物与相应的添加剂，提前放入6个容积为300ml的白钢发酵罐内，每个发酵罐提前预热并通入氮气，温度达到39℃后各发酵罐中装入50ml瘤胃液，并加入100ml人工唾液原液。发酵罐密封后放入恒温水浴摇床内（频率为85次/分）。数据采集仪器每间隔1min，依次（A-F）单独采集各发酵罐内气体数据，每6min循环一次，分析仪为集成一体机，利用单独的甲烷（德国SENSORSEUROPE公司）、二氧化碳（德国SENSORSEUROPE公司）、氧气（美国AMI公司）和氢气（英国CITY公司）浓度传感器对气体进行检测。

图1 六通路瞬时发酵微量产气全自动记录装置与软件系统

1.4 试验设计

试验采用完全随机化设计，发酵罐内的循环时间间隔为1min，试验重复5次，每次试验连续发酵12h。各添加剂的添加量为底物（羊草）的2%，因不同添加剂有纯度差异，使各添加量有所不同，具体如下：莫能菌素30mg，绿茶提取物35mg，硝酸钠45mg，活性炭40mg，酵素110mg，对照组无添加剂。

1.5 样品采集及分析

甲烷、二氧化碳和氢气产量由数据分析仪采集并直接记录。发酵12h后将发酵液用4层纱布过滤，按发酵液相应的比例加入25%的偏磷酸，混合后用10000×g离心10min，之后于-20℃冷冻保存，用于挥发性脂肪酸（VFA）测定，VFA用气相色谱外标法测定，发酵结束后立即用pH计测定各发酵罐中发酵液的pH值。

1.6 统计分析

使用Excel 2007进行初步整理，采用spss 19软件中的MIXED模型进行统计分析，显著水平为P＜0.05，并采用Duncan方法进行多重比较。

2 结果

2.1 添加剂对肉羊体外发酵产气量的影响

由表1可知，硝酸钠和莫能菌素组对甲烷产生量的抑制效果最为显著（P＜0.05），分别下降了28.49%和16.42%。活性炭、绿茶提取物对甲烷产量的影响并不显著（P﹥0.05）。酵素组与对照组相比甲烷产生量提高了3.7%。二氧化碳排放量硝酸钠显著高于对照组和莫能菌素（P＜0.05），绿茶提取物和酵素与对照组相比差异显著（P＜0.05）。氢气产生量硝酸钠和绿茶提取物，显著高于对照组和莫能菌素（P＜0.05）。

2.2 添加剂对肉羊瘤胃液挥发性脂肪酸的影响

由表2可知，对照组和五种添加剂乙酸、丙酸、丁酸浓度均发酵后均显著高于发酵前（P＜0.05）。五种添加剂和对照组相比乙酸、丙酸、丁酸浓度均未达到显著水平（P﹥0.05）。

3 讨论

3.1 硝酸盐

已有研究报道：硝酸盐类物质可作为非蛋白类氮源促进反刍动物瘤胃发酵功能。反刍动物瘤胃内甲烷的产生，主要依靠4H2+HCO3-+H+→CH4+3H2O的还原途径，是消耗瘤胃内多H2的重要途径。硝酸盐类物质进入瘤胃后，首先被还原成亚硝酸盐再被还原为氨，在这一过程中需消耗瘤胃内部分 H2，同时硝酸根离子具有较强氧化性，与甲烷菌 CO2-H2的还原途径相比更有利于被 H2还原。Amlan[7]和赵丽萍[8]等研究认为：合理计量的硝酸盐类物质进入瘤胃后作为电子受体，可有效降低甲烷排放量。本研究中以羊草为发酵底物，添加2%的硝酸盐后甲烷排放量降低了28.49%，与对照组相比仅丙酸浓度有下降趋势，但未达显著水平，说明硝酸盐未损害瘤胃发酵功能，与上述研究结果相一致。但硝酸盐作为电子受体，如短时间大量进入反刍瘤胃后，转化过程中如亚硝酸盐含量超过了微生物将其转化为氨的能力时，就会造成亚硝酸盐中毒，所以使用时必须严格控制添加计量，这也在一定程度上限制了硝酸盐在肉羊生产中的使用和推广。

3.2 莫能菌素

众多研究表明[9、10]莫能菌素能影响反刍动物瘤胃内能量代谢，改善瘤胃发酵功能，降低乙酸与丙酸的产出比例，从而减少甲烷排放，提高日粮利用率及生产性能，已广泛应用于反刍动物生产。Montoy的研究表明[11]，以青贮玉米为底物进行体外发酵试验时，添加0.0015mg/ml至0.003mg/ml的莫能菌素可以有效抑制甲烷排放量达30%～50%，但并未影响VFA浓度。本研究中莫能菌素组与对照组相比甲烷排放量降低了16.42%，减排量与报道差别较大，原因可能为发酵底物不同所致，但减排效果同样显著。VFV浓度与对照组相比未发生明显变化。近年来，食品安全越来越受到消费者的重视，莫能菌素作为抗生素类添加剂，已被欧盟等发达国家禁止使用，寻找抗生素类替代品是畜牧业科研工作急需解决的问题。

3.3 绿茶提取物

植物提取物的有效成分主要为植物次生代谢产物。植物的次生代谢产物是植物自我保护的一种机制因为其具有抗菌活性所以用来防止草食动物摄食和病菌等的侵入，在进入反刍动物瘤胃后通过改变其他细菌的活性来影响瘤胃内甲烷菌从而影响反刍动物的瘤胃产甲烷量。Mao等研究表明[12]：绿茶提取物中含有大量的皂苷类物质，当在肉羊日粮中添加使用时甲烷产生量被显著降低27%。在本研究中绿茶提取与对照组相比甲烷排放量和VFA浓度均未表现出显著差异，原因可能是添加剂量及发酵底物不同，不能达到有效抑制瘤胃甲烷菌群活性的目的。

3.4 活性炭

研究表明[13]，在水稻生产中使用活性炭可降低甲烷的产生量，因为活性炭是具有多孔性的物质，吸附能力较强，当活性炭与饲草或青贮的混合会提供一种理想的系统，可以在反刍动物瘤胃内通过吸附甲烷气体，从而降低甲烷产生量，同时不影响瘤胃发酵功能。这个结果说明在以干草做底物时添加活性炭并不会使甲烷产量发生明显改变，对VFA浓度也没有影响。这与本研究的结果相一致。Sand S I[14]等研究发现，体外发酵试验中当活性炭与硝酸盐类物质混合后，降低甲烷产量效果优于硝酸盐类物质单独添加。其原因可能是因为活性炭可以促进嗜甲烷菌的产生，其菌种特点是可以将甲烷作为唯一的碳源和能源，从而使瘤胃内甲烷含量降低。活性炭与硝酸盐混合使用，也许可为硝酸盐类物质在肉羊生产中的推广使用提供新的途径。

表1 不同添加剂对瘤胃发酵产气量的影响

表2 不同添加剂对瘤胃液VFA浓度的影响

3.5 酵素

酵素是指植物进行深层发酵，提取的一种含生物活性物质的低盐液体。其生物活性成分包括酶、发酵参与菌。可影响畜禽体内酶活性，从细胞层面调节机体的生命活动。酵素饲料添加剂一般是由多种益生菌株，运用生物发酵及复方配伍技术研制开发的一种绿色安全、无药物应激和药物残留的新型动物保健添加剂，在畜禽生产中具有抗应激、促免疫、健肠胃、促消化的功效，通过增强畜禽机体性能，间接提高饲料利用率，目前多用于单胃动物生产，在反刍动物生产中应用的研究报道较少。本研究中酵素对VFA浓度影响未达显著水平，反而增加了甲烷排放量，可能是由于酵素内多种酶的存在，促进了瘤胃内甲烷合成反应的进行，所导致的，其原因有待进一步论证。

4 小结

肉羊瘤胃液体外发酵以羊草为底物的研究中：绿茶提取物、活性炭、酵素在甲烷产生量和VFA的浓度变化都未达显著效果，故对瘤胃发酵能没有影响。硝酸盐不仅对甲烷产生量有显著的抑制效果，同时未改变VFA浓度，且作用效果优于莫能菌素，是肉羊生产中较为理想的潜在甲烷抑制剂。

[1]乐群，张国君，王铮.中国各省甲烷排放量初步估算及空间分布[J].地理研究，2012，31（9）：1559-1570.

[2]孙雨坤，赵玉民，闫晓刚，等.反刍动物甲烷代谢测定方法及其调控技术的研究进展[J].黑龙江畜牧兽医，2016，（8）：41-44.

[3]冯汝涵.畜牧业与温室气体排放[J].草业与畜牧，2010，（8）：50-51.

[4]金恩望，王加启，卜登攀，等.利用体外产气法研究植物精油对瘤胃体外发酵和甲烷生成的影响[J].中国农业大学学报，2013，18（3）：120-127.

[5]Feng Ruhan.Animal husbandry and greenhouse gas emissions[J].Prataculture and Animal Husbandry，2010，（8）：50-51.

[6]Beauchemin K A，Kreuzer M，O’Mara F，McAllister T A.Nutritional management for enteric methane abatement：a review[J].Australian Journal of Experimental Agriculture，2008，（48）：21-27.

[7]Amlan K P，Yu Z T.Combinations of nitrate，saponin，and sulfate additively reduce methane production by rumen cultures in vitro while not adversely affecting feed digestion，fermentation or microbial communities[J].Bioresource Technology，2014，（155）：129-135.

[8]赵丽萍.硝酸盐对肉牛瘤胃发酵、微生物多样性、血液生化及抗氧化性能的影响[D].中国农业大学，2015.

[9]李俐，刘小可，闫宏.日粮营养水平和添加莫能菌素对肉牛生产性能的影响[J].饲料工业，2012，（13）：41-44.

[10]陈志强，李爱华，洪龙，等.全混合日粮中添加莫能菌素对肉牛育肥效果的影响[J].黑龙江畜牧兽医，2011，（3）：67-69.

[11]Montoya J C，Campeneere S D，Ranst G V，et al.Interactions between methane mitigation additives and basal substrates on in vitro methane and VFA production[J].Animal Feed Science and Technology，2012，（176）：47- 60.

[12]Mao H L，Wang J K，Zhou Y Y，et al.Effects of addition of tea saponins and soybean oil on methane production，fermentation and microbial population in the rumen of growing lambs[J].Livestock Science，2010，（129）：56-62.

[13]Pereiraa R C，Muetzelb S，Arbestaina M C，et al.Assessment of the influence of biochar on rumen and silagefermentation：A laboratoryscale experiment[J].Animal Feed Science and Technology，2014，（196）：22-31.

[14]Sand S I，Preston T R.Biochar lowers net methane production from rumen fluid in vitro[J].Livestock Research for Rural Development，2012，（6）：24.

[15]Rhayour K，Bouchikhi T，Tantaoui-elaraki A，et al.The mechanism of bactericidal action of oregano and clove essential oils and of their phenolic major components on escherichia coli and bacillus subtilis[J].Joutnanl of Essential Oil Research，2003，（15）：286-292.