泽泻汤对巨噬细胞泡沫化脂质沉积及其IL—1β表达的影响

林高城　陈云欢　+杨莉惠　魏伟　+邹愉龙　陈雨

【摘要】 目的：观察泽泻汤对巨噬细胞泡沫化脂质沉积及IL-1β表达的影响。方法：采用 Ox-LDL（ 50 mg/L）处理大鼠腹腔巨噬细胞24 h，采用20%泽泻汤血清干预后，油红O染色观察细胞内脂质沉积情况；酶联免疫吸附（ELISA）法测定各组细IL-1β表达情况。结果：成功建立巨噬细胞泡沫化模型；相比于空白组的巨噬细胞，模型组巨噬细胞内脂质沉积增加明显，实验组巨噬细胞内脂质沉积显著减少，IL-1β呈低水平表达，与模型组比较差异有统计学意义（P<0.01）。结论：Ox-LDL（50 mg/L） 处理巨噬细胞可以成功建立巨噬细胞泡沫化模型。泽泻汤能改善巨噬细胞泡沫化过程的脂质沉积，其作用机制可能是通过下调IL-1β的表达来实现的。

【关键词】 泽泻汤； 泡沫细胞； IL-1β

Effect of Alisma Decoction on Lipid Deposition and Expression of IL-1β on Macrophagic Foam Cell Formation/LIN Gaocheng，CHEN Yunhuan，YANG Lihui，et al.//Medical Innovation of China，2017，14（35）：025-028

【Abstract】 Objective：To observe the effect of Alisma Decoction on lipid deposition and the expression of IL-1βon macrophagic foam cell formation.Method：Macrophagic foam cell formation was established after induction with oxidized low density liprotein（ox-LDL，50 mg/L） for 24 h and then the cells were intervened with 20% Alisma Decoction-containing serum.Oil red O staining to detect the lipid deposition in cells.Enzyme linked immunosorbent assay（ELISA） was used to determine the expression of IL-1β the cells of each group.Result：Ox-LDL（50 mg/L） treated macrophages successfully to establish macrophage foam model.Compared with the control group of macrophages，macrophage lipid deposition in the model group increased.The lipid deposition of macrophages in the experiment group decreased obviously.IL-1β was low expressed in the experiment group and the blank group.The level of IL-1β expression in the experiment group was significantly lower than that of the model group（P<0.01）.Conclusion：Ox-LDL（50 mg/L） treated macrophages successfully established a macrophage foam model.Alisma decoction can improve the lipid deposition in the process of macrophage foaming，this may be achieved by down regulation of IL-1β expression.

【Key words】 Alisma Decoction； Foam cell； IL-1β

First-authors address：Rehabilitation Hospital Affiliated of Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou 350000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.35.007

動脉粥样硬化（AS）是严重危害人类健康的常见病、多发病，是脑卒中和心肌梗死等疾病发病的共同基础。随着人们生活方式以及饮食习惯的改变，其发病呈现逐年上升的趋势。医学家张仲景创立泽泻汤，首载于《金匮要略·痰饮咳嗽病脉证并治》，全方仅由泽泻和白术这两味药物，据现代基础试验研究表明本方具有改善脂肪代谢、利尿、抗动脉粥样硬化等作用[1-3]。此次研究通过巨噬细胞泡沫化模型的建立，观察泽泻汤对巨噬细胞泡沫化脂质沉积的影响，探讨其与IL-1β的相关性，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器和材料 Ox-LDL购自广州奕源生物公司，胎牛血清购自FAA有限公司，油红O购自Sigma公司，苏木素购自北京中杉金桥公司，RPMI1640培养基购自广州硕恒生物科技有限公司，ELISA检测试剂盒购自武汉默沙克生物????科技有限公司。SD 大鼠（雄性）40 只，购自福建医科大学实验动物中心（许可证号：SCXK（闽）2012-0001），细胞培养箱（武汉普诺赛生命科技有限公司），倒置显微镜（北京瑞亿斯科技有限公司）等。endprint

1.2 制备泽泻汤 据《金匮要略》原方剂量比例配置泽泻汤，由泽泻、白术组成泽泻汤，福建省康复医院药剂科提供药品，以上中药均符合《中华人民共和国药典》2005年版有关规定。制备相当于生药材2.64 g/mL的药液：第一次煎药添加水量与药量的比为6∶1，浸泡1 h后再煎20 min；第二次煎药添加水量与药量的比为4∶1，煎0.5 h后两次药液混合，再浓煎蒸馏，制备完毕后4 ℃冰箱储存备用。

1.3 SD大鼠腹腔巨噬细胞提取及细胞培养 先向SD大鼠腹腔内注射10 mL RPMI1640培养液，72 h后以颈椎脱臼法处死。然后腹腔内注射RPMI1640培养液10 mL，75%酒精浸泡5 min，严格无菌操作条件收集腹腔内液，1500 r/min离心5 min后收集细胞，用含10%胎牛血清的无酚红RPMI1640培养液调整细胞数至5×106 mL/L，将细胞接种到覆有盖玻片的6孔板和25 cm2培养瓶中，置5% 二氧化碳、37 ℃孵箱培养6 h，经显微镜观察细胞贴壁后弃去上清液，PBS冲洗液洗去未贴壁细胞。

1.4 泽泻汤含药血清的制备 清洁级雄性SD 大鼠40 只，体重200～210 g。饲养4 d后，清洁级雄性SD大鼠随机分为空白血清组（注射相同量的生理盐水）和泽泻汤含药血清组，随机分配各组20只。按大鼠重量100 g给予1 mL灌胃给药，每天灌药2次，连续灌药7 d，第8天灌药2 h后腹腔注射麻醉，腹主动脉采血，于4℃ 3000 r/min离心10 min分离血清。全部离心后合并血清，56 ℃灭活30 min，微孔滤膜过滤除菌，于-20 ℃保存待用。制备完毕后的血清均在4周内使用。

1.5 细胞干预方法以及分组 模型组：大鼠腹腔巨噬细胞+Ox-LDL （泡沫细胞，50 mg/L），培养48 h后提取细胞备用；空白组：大鼠腹腔巨噬细胞+20%正常大鼠血清，培养48 h后提取细胞备用； 实验组：在大鼠腹腔巨噬细胞+Ox-LDL （泡沫细胞，50 mg/L）孵育24 h后，加入含有20%泽泻汤含药血清的RPMI1640培养基孵育细胞，继续培养24 h后提取细胞备用，以上每组实验均重复3次。

1.6 油红O及苏木素染色 先取出干预后细胞（6孔板），然后PBS 洗涤细胞标本1次，之后用4%多聚甲醛固定15 min，紧接油红O染色细胞10 min，苏木素染色细胞5 min，最后10 mL/L HCl分色及返蓝，水性封片剂封片备用。普通显微镜下观察，细胞内脂质呈红色，细胞核呈蓝色。

1.7 ELISA检测各组实验细胞IL-1β的表达 收集各组细胞的上清液，采用双抗体一步夹心法ELISA法。往预先包被IL-1β抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、辣根过氧化物酶标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成藍色，最后加终止液硫酸。用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

1.8 统计学处理 采用SPSS 13.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 含有泽泻汤血清干预后对巨噬细胞源性泡沫细胞形成率的影响 大鼠腹腔巨噬细胞与Ox-LDL共同培养48 h后，然后用PBS洗涤孵育后的细胞2次，试验中先后采用油红O与苏木素染色，显微镜下观察发现巨噬细胞的胞浆内存在大量红色的脂滴，苏木素染色后细胞核呈蓝色，细胞伪足在模型组明显增加，以上特征均提示巨噬细胞源性泡沫细胞成功建立，使用20%泽泻汤含药血清干预后的细胞内红色脂滴颜色较前明显变淡，充分提示脂质沉积减轻，见图1。

2.2 泽泻汤含药血清对巨噬细胞源性泡沫细胞IL-1β浓度的影响 模型组IL-1β浓度为（12.5±0.48）ng/L，空白组为（7.52±0.52）ng/L，实验组为（9.61±0.42）ng/L，模型组与空白组比较差异有统计学意义（P<0.01），实验组与模型组比较差异有统计学意义（P<0.01）。

3 讨论

随着人们生活水平的提高及饮食习惯的改变，AS为病理基础的心脑血管疾病发生率呈逐年上升趋势，并成为致死的重要原因。寻找AS的发病机制，并以此为作用点延缓或逆转AS发生及发展，是降低脑中风、心肌梗死等心脑血管疾病的关键因素。AS是一个复杂而漫长的过程，脂质氧化和炎性反应在其形成与发展中起着关键性作用[4-6]，它的发展起源于内皮细胞的功能失调导致炎症细胞的激活，使单核细胞粘附并聚集在血管内膜下形成巨噬细胞。

巨噬细胞在AS形成中起重要作用，巨噬细胞吞噬脂质后分化成为泡沫细胞[7]，这是AS形成过程中重要的病理基础。Ox-LDL与巨噬细胞汇集后，巨噬细胞膜上有关蛋白被进一步激活，通过清道夫受体摄取Ox-LDL，巨噬细胞最终形成泡沫细胞，并分泌各种介质，如IL-1β和大量基质蛋白酶等，促进AS的形成。

东汉时期张仲景在《金匮要略》中首创泽泻汤，现代实验研究表明，泽泻汤具有降脂、利水、抗动脉粥样硬化等药理作用，在心脑血管疾病中应用甚广。刘金元等[8]通过动物实验发现泽泻汤对大鼠血脂代谢及血液流变学指标有调节作用，对AS具有逆转作用，其可降低动脉粥样斑块内脂质体。王玉仙等[9]应用泽泻汤治疗脂肪代谢异常，发现该方可改善脂肪代谢异常所致临床症状，而且能抑制脂类物质吸收，明显降低胆固醇水平；但是其作用机制是否与IL-β有关，目前尚未见研究报道。

IL-1β通过与配体的结合介导单核细胞在血管内皮表面粘附聚集，在AS过程中发挥重要作用[10]。Olofsson等[11]采用RT-PCR对人肾动脉IL-1β的mRNA水平进行测定，结果显示动脉粥样斑块处IL-1β的mRNA水平显著高于健康人群。Lindholm等[12]以脂蛋白处理后的巨噬细胞作为研究对象，含IL-1β的培养基培养上述细胞，发现IL-1β可明显减少上述巨噬细胞中脂质代谢，而且增加内源性泡沫细胞的形成。目前研究认为IL-1β可通过多种途径参与AS进程[13-18]，IL-1β可诱导内皮细胞表达多种粘附分子及趋化因子，使血管通透性增加以及产生有细胞毒性的脂质过氧化物；可刺激血管内皮细胞增殖，提高凝血酶原活性，促进中性粒细胞对血管壁的粘附及平滑肌细胞增生，外周血单核细胞迁入内皮下间隙被激活并分化为巨噬细胞，进而摄取脂质形成泡沫细胞，从而促进AS的发生和发展。endprint

在本研究中通过油红O染色的方法观察巨噬细胞内脂质沉积情况，成功建立巨噬细胞源性泡沫细胞模型，并发现泽泻汤含药血清干预后的细胞内红色脂滴颜色较淡，脂质沉积减轻，提示泽泻汤具有改善脂质代谢作用，而改善脂质代谢在抗AS过程中起到基石作用。本研究发现，模型组泡沫细胞的IL-1β呈高水平表达，加入泽泻汤含药血清后能够明显降低IL-1β的表达水平， 提示泽泻汤对泡沫化的巨噬细胞分泌的IL-1β有抑制作用，而IL-1β在AS进程中起到重大推动作用[19-20]。因此笔者推测泽泻汤可能通过抑制IL-1β表达以改善巨噬细胞泡沫化进程中脂质沉积。并进一步抑制AS的发生与发展，该试验研究结果进一步证明泽泻汤抗AS的药理作用，为以后研究泽泻汤提供了新的思路和理论基础。

参考文献

[1]胡雪峰，成忠煌，王松迪，等.泽泻汤降血脂作用的研究[J].时珍国医国药，2011，22（9）：2073-2074.

[2]赵润生，邢玉敏，张永志，等.泽泻汤加噬方对高脂血症患者颈动脉粥样硬化及内皮功能的影响[J].引文版：医药卫生，2015（5）：28.

[3]付涛，姜淋洁，陈桂林，等.泽泻汤降血脂及抗氧化作用有效部位的研究[J].时珍国医国药，2012，23（2）：266-268.

[4] Adam D，Caroline D，Jing S，et al.Interleukin-1 mediates neuroinflammatory changes associated with diet-induced atherosclerosis[J].J Am Heart Assoc，2012，1（3）：e 002 006.

[5] Ray K K.Interleukin-1 revisited：further insights into its role in atherosclerosis and as a potential therapeutic target for treatment[J].Journal of the American College of Cardiology，2014，63（17）：1735-1738.

[6] Mccarty S，Frishman W.Interleukin-1β：a proinflammatory target for preventing atherosclerotic heart disease[J].Cardiology in Review，2014，22（4）：176-181.

[7] Tiwari R L，Singh V，Barthwal M K.Macrophages： An elusive yet emerging therapeutic target of atherosclerosis[J].Medicinal Research Reviews，2008，28（4）：483-544.

[8]刘金元，杨冬娣，张慧婕.加味泽泻汤对动脉粥样硬化模型大鼠的治疗作用[J].江苏中医药，2008，40（6）：87-88.

[9]王玉仙，马学荣.泽泻汤加味治疗高脂血症103例[J].陕西中医，2005，26（2）：103-104.

[10]庄庭怡，毛静远.冠心病心绞痛与肿瘤坏死因子-a、白介素-1β及白介素-6关系的研究概况[J].中国心血管病研究，2007，15（8）：613-614.

[11] Olofsson P S，Sheikine Y，Jatta K，et al.A functional interleukin-1 receptor antagonist polymorphism influences atherosclerosis development. The interleukin-1β：interleukin-1 receptor antagonist balance in atherosclerosis[J].Circulation Journal，2009，73（8）：1531-1536.

[12] Lindholm M W，Jan N，Jenny P.Interleukin-1beta and tumour necrosis factor-α impede neutral lipid turnover in macrophage-derived foam cells[J].BMC Immunology，2008，9（1）：70.

[13] Rios D L，Cerqueira C C，Lj B S R，et al.Interleukin-1 beta and interleukin-6 gene polymorphism associations with angiographically assessed coronary artery disease in Brazilians[J].Cytokine，2010，50（3）：292-296.

[14] Sironi M，Sciacca F L，Matteucci C，et al.Regulation of endothelial and mesothelial cell function by interleukin-13：selective induction of vascular cell adhesion molecule-1 and amplification of interleukin-6 production[J].Blood，1994，84（6）：1913-1921.

[15] Wang X，Feuerstein G Z，Gu J L，et al.Interleukin-1β induces expression of adhesion molecules in human vascular smooth muscle cells and enhances adhesion of leukocytes to smooth muscle cells[J].Atherosclerosis，1995，115（1）：89-98.

[16]肖玲，李匯源，林亚新，等.颅内动脉粥样硬化斑块内核转录因子与白介素-1β的表达与斑块稳定性的相关研究[J].卒中与神经疾病，2010，17（6）：330-332.

[17]奚卉，洪涛.白介素-1家族在动脉粥样硬化中的作用[J].医学与哲学，2016，37（6）：55-57.

[18]刘艳红.动脉粥样硬化进程中单核/巨噬细胞IL-1、IL-6的表达[J].海南医学，2015，26（19）：2818-2820.

[19]江高峰，秦旭平，李洁.免疫炎症反应在动脉粥样硬化中作用的研究进展[J].中南医学科学杂志，2015，43（2）：212-216.

[20]单雪峰，陈铀，孙清超，等.冠状动脉粥样硬化患者细胞因子信号转导抑制剂1基因表达的临床意义[J].中国医药导报，2016，13（8）：112-115.

（收稿日期：2017-08-16） （本文编辑：程旭然）endprint