新疆石河子地区犬源立克次体病流行病学调查*

李重阳，孟庆玲，乔 军*，伍晔晖，王立霞，郭 晶，马 帅，才学鹏

(1.石河子大学 动物科技学院， 新疆 石河子 832003； 2.中国农业科学院 兰州兽医研究所，甘肃 兰州)

立克次体目为革兰氏染色阴性、细胞内专性寄生菌，属于a-变形菌纲(a-Proteobacteria)。立克次体目中的立克次体属、埃立克体属和无形体属的媒介主要是硬蜱，宿主为多种脊椎动物，硬蜱叮咬是人或宿主动物感染立克次体的主要途径[1-4]。在临床上，人感染立克次体表现为局部淋巴结病变，可有疼痛，随后出现发热和皮疹[1-2]。自1899年首次报道人落基山斑点热以来，世界各地相继发现20多种致病性立克次体[5]。在20世纪80年代末期，美国相继发现人单核细胞埃立克体病和人粒细胞埃立克体病，并从病人的血液样本中分离到HME病原体查菲埃立克体(E.chaffeensis)和HGE的病原体嗜吞噬细胞无形体(A.phagocytophUum)[6]，引起了世界各国对无形体科及其引起的疾病的重视。现已发现的埃立克体有5种，无形体有6种，有多个新发现的埃立克体和无形体尚未分类[7]。

犬感染埃立克体会出现发热、嗜睡、厌食、黏膜苍白、脾脏肿大、出血，并成为持续携带者[8]。经蜱传染的犬埃立克体和犬无形体是导致犬单核细胞埃立克体病(CME)和犬循环血小板减少症(CCT)的病原体，也可引起人感染。自阿尔及利亚首次检测到犬埃立克体以来，随后在美国[9]、欧洲[10]、亚洲[11]和非洲[12]的一些国家相继广泛被检测到。犬作为人类重要的伴侣动物，分析鉴定犬立克次体的流行特点对于预防我国人立克次体感染有重要公共卫生学意义。因此，本研究利用PCR检测立克次体16S rRNA基因，分析新疆石河子地区犬立克次体的感染和流行状况。在此基础上，通过遗传进化分析揭示立克次体，犬埃立克体及无形体石河子流行株与国内外流行株的亲缘关系，为该病的防控提供分子流行病学资料。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

DNA Marker、pMD19-T(simple)载体均购自TaKaRa公司；DNA提取试剂盒购买于天根(北京)生化科技有限公司；质粒小量提取试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒购自诺维森(北京)生物科技有限公司。

1.2 样本的采集

在石河子地区采集犬体表寄生蜱655只，并在石河子市宠物医院采集犬全血58份。样本蜱于-20 ℃或70%酒精保存，检测前进行形态学鉴定，新鲜血液于4 ℃保存。

1.3 样本DNA提取及PCR检测

根据试剂盒说明，对采集的血液和蜱组织进行DNA的提取，用乙醇沉淀DNA，用DD水洗脱，-20 ℃保存待检测。然后利用特异性引物扩增立克次体16S rRNA基因，上游引物:5'-GGTACCYACAGAAGAAGTCC-3'和下游引物：5'-TAGCACTCATCGTTTACAGC- 3'；扩增埃立克体16S rRNA基因，上游引物：5'-TTTATCGCTATTAGATGAGCCTATG-3'和下游引物：5'-CTCTACACTAGGAATTCCGCTAT-3'。PCR反应体系为50 μL，包括：5 μL DNA模板，各1 μL上下游引物，5 μL10×PCR buffer，1 μL Tap酶，4 μL dNTP mixture，灭菌去离子水加至50 μL。立克次体目的基因PCR反应条件：95 ℃，预变性5 min；94 ℃，变性40 s；52 ℃，退火40 s；72 ℃，延伸40 s；扩增35个循环；72 ℃延伸7 min。犬埃立克体目的基因PCR反应条件：95 ℃，预变性2 min；94 ℃，变性1 min；52 ℃，退火40 s；72 ℃，延伸40 s；扩增40个循环；72 ℃延伸7 min。PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳。

1.4 DNA序列的克隆及测序

利用PCR纯化试剂盒对扩增产物进行纯化，将纯化产物连接到pMD19-T(simple)载体，连接体系(10 μL)：Solution I 5 μL，回收的目的片段4.5 μL，pMD19-T(simple)载体0.5 μL。连接产物混匀瞬时离心后于4 ℃连接过夜。将5 μL连接产物转化到感受态细胞E.coliDH5α中，然后涂在有氨苄青霉素的LB培养基平板培养，在平板上挑取菌落进行PCR鉴定，筛选阳性克隆送上海生工生物技术公司进行测序。

1.5 16S rRNA基因遗传进化分析

利用BLAST N在线软件，将测序结果与GenBank 中注册基因序列进行同源性比对。使用DNAstar8.0软件进行同源性分析，使用MEGA5.0 软件通过NJ(Neighbor-Joining)法构建系统进化树(Bootstrap值为1000)。

2 结果与分析

2.1 蜱形态学鉴定结果

釆集犬体表寄生蜱655只，参照《新疆蜱类志》[13]及《中国经济昆虫志》[14]，通过体式倒置显微镜进行形态学和分子生物学鉴定，为血红扇头蜱和俄扇头蜱两种，其中血红扇头蜱612只，俄扇头蜱43只(图1)。

2.2 PCR检测结果

经PCR从采集的蜱中扩增到52份立克次体阳性，其中俄扇头蜱7份阳性，血红扇头蜱45份阳性，犬血液中没有检测到立克次体阳性，扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳验证，出现345 bp大小的条带(图2)，结果与预期目标条带分子量大小相符。使用犬埃立克体特异性引物，扩增到87份犬埃立克体阳性，其中俄扇头蜱15份阳性，血红扇头蜱72份阳性，血液中检测到7份阳性，扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳验证，出现452 bp大小的条带(图3)，结果与预期目标条带分子量大小相符。同时利用此引物从蜱中检测出无形体阳性样本28份，血液中检出无形体阳性3份，扩增目的片段为452 bp(图3)。

2.3 16S rRNA基因遗传进化分析

将阳性样本送至上海生工测序，Shz-1与乌拉圭的Rickettsialesbacterium( EF687768.1)序列同源性达到99%且在同一分支，与其它Rickettsiales同源性在86.96%以上，在进化树分支上相距较近，提示Shz-1可能是一种立克次体新基因亚型(图4A)。Shz-2序列与Ehrlichiasp. HF(CP007474.1)、Ehrlichiasp.Yunnan(GU227701.1)、Ehrlichiaewingii( NR_044747.1)、Ehrlichiachaffeensis(CP007480.1)同源性达到99%；与E.platysGzh981和E.canisGzh982株同源性分别为92.27%、98.89%；在进化树中与Ehrlichiasp. Yonaguni206(HQ697589.1)处于同一分支，和Ehrlichiasp. HF(DQ647318.1)、Ehrlichiamuris(AB013009.1)处于较近的分支；与巴西、马来西亚半岛、土耳其、马来西亚、台湾、日本、美国、意大利南部的Ehrlichiacanis(EF195135.1、 KR920044.1、KJ513197.1、JF429693.1、GU810149.1、AF536827.1、NR_118741.1、EU439944.1)同源性达到98.67%以上，且处于较近分支，提示Shz-2可能是一种犬埃立克体新基因亚型(图4B)。Shz-3序列与Anaplasmasp.cloneXinjiang051-9(JX402604.1)、Anaplasmaphagocytophilum(CP006618.1、AY527213.1、GQ412337.1)同源性为99%～100%；与Anaplasma(KJ410247.1、KJ410248.1、KJ410249.1)处于同一分支，和其它A.phagocytophilum在进化树中处于较近分支(图4C)。Shz-1、Shz-2、Shz-3石河子流行株用箭头标识。

图3 犬埃立克体和无形体16S rRNA PCR扩增结果M. DNA分子标准质量；3-6.犬埃立克体阳性样本；7.无形体阳性样本；1-2.阴性样本 Fig.3 Amplification of 16S rRNA genes of Ehrlichia caniand Anaplasma by PCRM. DNA Marker DL2000;3-6. Ehrlichia cani Positive samples;7. Anaplasma Positive samples;1-2. Negative samples

3 讨 论

从20世纪80年代以来，在新疆陆续检测或分离出多种蜱媒疾病病原体，包括莱姆病原体、康氏立克次体(R.conorii)、Candidatusrickettsiabarbariae、R.slovaca、R.raoulti和A.phagocytophilum等。病原学调查发现，不同地区蜱携带立克次体有明显差异[15]。在北疆地区，在精河的草原革婢中分离出SFGR；在玛纳斯、精河县等地的蜱中分离出莱姆病螺旋体、SFGR并检测出A.phagocytophilum[16]；在伊梨历史上被证实为蜱传斑点热自然疫源地，范德生等[17]首次证实了伊犁当地人群血清以及当地家畜马牛羊中都存在无形体抗体阳性；在南疆地区，在尉犁荒漠地区的短小扇头蜱中检出SFGR和与中央无形体(A.centrale)同源性最高的无形体[18]，在和硕地区的俄扇头蜱中检测出A.phagocytophilum和SFGR等[3]。在新疆博乐和塔城地区也同样检测到立克次体，无形体和埃立克体。

埃立克体病主要分布在美国东南部以及中南部地区[15，19]，世界上其他部分地区如墨西哥、以色列、意大利、葡萄牙、泰国、韩国、日本等证实有该病的血清阳性人群[17]。1998年，广州军区军事医学研究所兽医研究室在广州市郊某养犬基地发现了犬埃立克体病的流行，证实引起发病的病原为两种埃立克体E.canis和E.platys，经测序病原的16S rRNA并在Genbank比对后，两株埃立克体分别命名为Gzh981(E.platys)和Gzh982(E.canis)。我国在1999年报告了首例埃立克体病例。2001年在大兴安岭地区人群血中检测到查菲埃立克体和人粒细胞埃立克体的16S rRNA基因片段。2006年1月，在安徽宣城县首次出现10例确诊的无形体病例，其中一例死亡，并且证实了该病原体可以在人与人之间传播。

图4 立克次体、埃立克体、无形体石河子流行株16S rRNA基因遗传进化分析A：立克次体；B：埃立克体；C：无形体Fig.4 Phylogenetic analysis of 16S rRNA genes of Rickettsia, Ehrlichia, Anaplasma A. Rickettsia; B. Ehrlichia; C. Anaplasma

石河子地处新疆北部，位于古尔班通古特沙漠边缘，生态环境多样，是蜱等媒介传染病的多发地，蜱传立克次体和犬埃立克体的传播风险较大。由于埃立克体和无形体可引起人感染，因此应加强对该病的病原学和分子流行病学调查。本研究在655只犬体表蜱样本和58份犬血液样本中，蜱中检出52份立克次体阳性样本，占7.9%，87份埃立克体阳性样本，占13.3%，28份无形体阳性样本，占4.3%；血液中7份埃立克体阳性样本，占12.1%，3份无形体阳性样本，占5.1%。在本研究中，获得的16S rRNA基因序列分别与GenBank中部分立克次体、埃立克体、无形体的序列同源性达到99%以上；遗传进化分析显示，新疆石河子地区犬源立克次体、埃立克体及无形体流行株与国内外流行株具有较近的亲缘关系，但也存在一定的变异。近年来，随着宠物犬数量的上升，犬作为人类重要的伴侣动物，犬携带的立克次体和人类密切，因此开展犬源立克次体病的流行病学调查对于防控人立克次体的感染具有重要的意义。

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