不同基源铁棒锤种子的鉴别

2018-01-24，，，，

种子 2017年11期

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(甘肃中医药大学，兰州 730000)

铁棒锤种子为毛茛科乌头属植物铁棒锤(AconitumpendulumBusch.)和伏毛铁棒锤(A.flavumHand.Mazz.)的干燥成熟种子。其块根被《中华人民共和国卫生部药品标准(藏药)》[1]第一册以“铁棒锤”收录，是甘、青、宁、藏等地应用较广的一种民间草药，具有活血祛瘀、祛风湿、止痛等作用[2]。近年来，随着铁棒锤药用范围拓宽，其开发利用备受关注[3-5]。长期以来一直以野生资源入药，随着市场需求的增加，人工驯化栽培已显得日益迫切，其种子的真伪尤为重要，直接关系到药材的真伪优劣，为保证药材质量，研究一套适合其种子鉴别的方法，对铁棒锤种质资源的保护、评价、种子鉴定、育种以及铁棒锤规范化种植具有重要意义[6]。

性状鉴定是中药鉴定的基础，是一种最简单、最直观的鉴定方法[7]，是评价中药品质的特色方法之一，具有简单、迅速、易行等特点。中药组织形态和粉末形态具有生物学稳定的特性，富有规律性和专属性，其组织构造和细胞中的代谢产物等与质量密切相关，显微鉴定在某种程度上也反映了中药的内在质量[8]，半显微性状鉴定法[9]是一种介于性状和显微鉴别之间的鉴别方法，通过借鉴扫描仪、体视显微镜等仪器观察中药材细微的外观性状以达到鉴别的目的，在中药真伪鉴定方面发挥了重要作用。

目前，有关铁棒锤种子的研究主要集中在化学成分及品质方面[10-11]，但关于不同基源铁棒锤种子鉴别方面的研究尚未见报道。故本试验以不同基源铁棒锤种子为研究对象，通过性状、显微、半显微性状鉴别，研究出一套适合其种子鉴别的方法，为铁棒锤种质资源的保护、评价、种子鉴定、育种以及铁棒锤规范化种植提供理论依据。

1 仪器材料与试剂

1.1 仪器

冷冻切片机(德国产Leica-CM 1950 型)；一次性刀片(日本产Feather)；尼康80 i显微成像系统(日本产)；扫描电镜(阿美特克产)；T式显微镜(日本产SMZ 800)；镊子(金卡思官方旗舰店)；解剖针(廊坊市智航科教仪器有限公司)、游标卡尺(桂林广陆数字测控股份有限公司)。

1.2 试剂

OCT包埋剂(美国制造，批号 FEB-2017)、文化胶水(北京雪奥文化用品制造有限责任公司，批号1065)、载玻片及盖玻片(江苏世泰实验器材有限公司)、水合氯醛(天津市大茂化学试剂厂2015120)、丙三醇(天津市大茂化学试剂厂2014920)、甘油(天津市大茂化学试剂厂2015203)，试验用水合氯醛试液按《中华人民共和国药典》2015版三部(通则8002)项下配制。

注：左图为铁棒锤种子；右图为伏毛铁棒锤种子。图1 铁棒锤种子

图2 铁棒锤种子解剖图

1.3 材料

铁棒锤种子2016年10月收集于甘南州合作市铁棒锤种植基地；伏毛铁棒锤种子2016年10月收集于甘肃省临夏回族自治州和政药用植物园。经杜弢教授鉴定为铁棒锤和伏毛铁棒锤种子。

2 方法

2.1 性状鉴定

观察铁棒锤种子形状、表面特征及颜色、质地、断面及气味，并用游标卡尺测量其种子大小。

2.2 显微鉴定

2.2.1 组织鉴定[12]

1) 前处理：挑选饱满的不同基源的铁棒锤种子于培养皿中，用蒸馏水浸泡1～7 d，备用。

2) 固定样品：设定冷冻切片机温度-20 ℃，刀片固定在切片机的刀槽上，将试验用的毛笔、镊子、托盘放入冷冻切片机内一起降温。待温度降到-18 ℃以下时，用毛笔刷去冷台上的薄霜。于托盘上滴加OCT或高粘度文化胶水，并用镊子挑取饱满种子均匀地包埋于OCT或高粘度文化胶水中。置于冷台上，迅速冷冻2～3 h使种子牢固地黏附于托盘上，即可。

3) 切片：将托盘置于冷台固定槽上，旋转切片厚度调为8μm，摇动旋转手轮进行切片。

4) 展片：用毛笔刷将切片移到载玻片上，或将载玻片直接以合适的位置靠近刀片。由于温差作用，切片自动黏附在载玻片上。取出载玻片，进行形态学观察。

5) 观察、拍照：使用尼康80 i显微成像系统观察并拍照。

2.2.2粉末鉴定

取铁棒锤和伏毛铁棒锤种子于研钵中研碎后过50目筛。取粉末少许，置洁净的载玻片上，滴加1～2滴水合氯醛加热透化后装片，于显微镜下观察并拍照。

2.3 半显微性状鉴定

将不同基源的铁棒锤种子除去外种皮，用蒸馏水浸泡变软后用滤纸吸干表面水分，固定在双面胶上，置体视显微镜及扫描电镜中观察并拍照。

3 结果与分析

3.1 铁棒锤和伏毛铁棒锤种子性状鉴定

由图1可知，2种不同基源的铁棒锤种子形状相似，呈倒卵状三棱形。铁棒锤种子长3～4 mm，宽2～3 mm，厚1～2 mm；表面黑色或黑棕色，伏毛铁棒锤种子长2.1～2.9 mm，宽1.3～2.2 mm，厚1.1～1.8 mm。表面黑褐色，二者均具3条翅状纵棱，外种皮薄而脆，较易破碎，内种皮表面颜色较浅，呈黄棕色或淡棕色，具梯状纹理。质脆易碎，除去种皮，种仁类白色(图2所示)。气微，味苦。二者种子性状相比，铁棒锤种子较伏毛铁棒锤种子大，表面颜色深。

3.2 铁棒锤和伏毛铁棒锤种子组织切片鉴定

由图3和图4可知，铁棒锤和伏毛铁棒锤种子组织结构相似，均由外种皮、内种皮、胚乳和胚4部分组成。横切面：外种皮为一列长方形棕黄色厚壁细胞，内种皮细胞为一列长方形细胞，切向延长，壁较薄，细胞内具梯状纹理，作纵向排列，相邻细胞间有间隙；胚乳细胞多层，呈多角形作径向延长排列，内含糊粉粒；胚位于中央，多为类圆形、半圆形、钩形，外层细胞呈近长方形切向排列，靠近里面呈近圆形作径向排列(如图3 A和图4 C所示)。纵切面：种皮为一列长方形棕黄色厚壁细胞，内种皮细胞为一列长方形细胞，径向延长，细胞内具梯状纹理，作切向排列；胚乳多层，呈多角形或近长方形作切向延长排列；胚位于下方，外部细胞呈近长方形，内部细胞呈类圆形作径向排列(如图3 B和图4 D所示)。

图3 铁棒锤种子的横(纵)切组织切片图

图4 伏毛铁棒锤种子的横(纵)切组织切片图

图5 铁棒锤种子粉末图

图6 伏毛铁棒锤种子粉末图

3.3 铁棒锤和伏毛铁棒锤种子粉末鉴定

铁棒锤种子粉末呈灰黑色，伏毛铁棒锤种子粉末呈灰褐色或黄褐色，二者粉末特征均包括外种皮、内种皮、胚乳、糊粉粒4种细胞(见图5、图6)。外种皮细胞黄褐色或灰黄色，呈近长方形，壁厚；内种皮细胞棕黄色，呈多角形，具梯状纹理，径向壁呈连珠状增厚；胚乳细胞多角形，内含团块状的糊粉粒。二者种子粉末相比较，铁棒锤种子外种皮细胞较伏毛铁棒锤狭长。

3.4 铁棒锤和伏毛铁棒锤种子半显微性状鉴定

由图7可知，不同基源铁棒锤种子外种皮细形状胞相，呈长方形，壁较厚，作径向排列，但铁棒锤外种皮细胞较伏毛铁棒锤狭长，且表面颜色较深；二者内种皮细胞表面微观特征相似，呈多角形，具梯状纹理。

4 讨论与分析

4.1 种子浸泡时间对切片效果的影响

为得到适宜的浸泡种子时间，冷台温度为-20 ℃条件下，观察不同浸泡时间(1～7 d)对其切片的影响。结果发现，当冷台温度为-20 ℃时，浸泡不同时间，2种铁棒锤种子组织切片效果不同，铁棒锤种子浸泡2～4 d，切片完整，细胞形态清晰、效果较好；而伏毛铁棒锤种子浸泡2～5 d时，切片效果较好。其原因可能是伏毛铁棒锤种子较铁棒锤饱满，需要软化时间长。

图7 不同基源铁棒锤种子表面微观特征图

4.2 种子冷冻时间对切片效果的影响

冷台温度为-20 ℃条件下，考察冷冻时间(1～6 h)对组织切片的影响。结果表明，冷冻2～3 h切片效果较好。冷冻时间为0.5～1 h，因冷冻时间较短，包埋剂不够坚硬，切片时易产生刮片，影响成片；冷冻时间为4～6 h，因冷冻时间太长，产生太多冰晶，导致细胞较脆，容易破损，切片时产生空洞进而造成胚丢失，影响切片的完整性。故铁棒锤种子最佳冷冻时间为2～3 h。

4.3 切片厚度对细胞形态的影响

将切片厚度从14μm不断降低调整到7μm，观察其切片效果。结果发现，当切片厚度调整为10μm 以上时，由于切片太厚，各组织结构、细胞形态不清晰；切片厚度调整为7μm 时，由于太薄，导致细胞破裂，切片中各组织结构不完整；切片厚度调整为8μm 时，镜下观察，其组织结构能较完整地呈现，细胞形态清晰、无空泡、空网状及冰晶的形成。

4.4 包埋剂对切片效果的影响

实验分别用粘性较大的文化胶水和粘性较小的OCT做包埋剂，考察其对切片效果的影响。结果表明，铁棒锤种子适宜用文化胶水做包埋剂，而伏毛铁棒锤种子适宜用OCT做包埋剂。其原因可能是铁棒锤种子较大而干瘪，种皮皱缩，用OCT做包埋剂时，由于粘性较小，各组织粘结不紧密，有空洞易导致胚脱落，切片不完整；而伏毛铁棒锤种子小且饱满，2种胶水均可作为包埋剂。