植物种子发育相关NAC家族转录因子研究进展

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(贵州师范大学荞麦产业技术研究中心， 贵阳 550001)

1 植物种子发育过程研究

高等植物种子的发育开始于胚珠里发生的双受精过程，结束于形成下一代繁殖所需的成熟的休眠种子。从形态学来说，种子发育过程经历3个标志性的时期，即细胞分化、器官形成和种子成熟[1]。以模式植物拟南芥为例(图1)[2]，从花受精到种子成熟一共持续19 d，期间种胚发育过程从原胚期开始(0 d)，经过球形胚前期(1 d)、球形胚期(3～4 d)、心形胚期(5～6 d)、鱼雷形胚期(7～8 d)、绿熟期(13～14 d)，到种子后熟期(18～19 d)，然后种子进入休眠状态，等待下一代萌发。胚乳发育包括游离核期、细胞化期和吸收期。胚柄和胚体的分化发生在受精后1～5 d，细胞和组织的分化发生在受精后4～6 d，顶端/根分生组织的分化在受精后第5天，子叶和轴的发育在受精后6～18 d，营养储存物质的积累从受精后第7天开始，一直到种子后熟(第19天)。种子后熟时种子大量失水，随后进入休眠期。从细胞角度而言，受精后前8 d主要是细胞分化时期，9～19 d主要是细胞扩张时期。

种子的发育和营养物质积累过程依赖于大量基因的表达和调控，研究这些基因的表达调控规律有助于了解种子发育过程中各种营养物质积累的分子机制。拟南芥[2]、水稻[3]、小麦[4]、大豆[5]、油菜[6]、大麦[7]等种子发育过程的转录组学分析挖掘了大量与之相关的调控和功能基因。转录因子是参与植物表达调控的重要反式作用因子,它们在种子发育和籽粒灌浆的过程中具有重要调控作用[1]。玉米种子发育过程中共检测到414个转录因子的表达，其中113个转录因子在发育的胚乳中优势表达，它们主要为bZIP(13%)、锌指蛋白(17%)和NAC(11%)几个家族成员[8]。对玉米发育不同时期和组织的基因表达情况进行分析，筛选出218个在种子中上调表达的转录因子，它们分属于43个不同的转录因子家族，包括MYB、AP 2、B 3、NAC等[9]。大豆种子发育过程中的转录组学分析表明，19个转录因子在脱水和干旱的种子中的表达量高于幼嫩时期的种子[5]。颖片是离种子最近的营养器官，19个WRKY和16个NAC转录因子在大麦种子灌浆期上调表达，表明这些转录因子可能参与调控能量从颖片向种子的转运[7]。油菜灌浆期种子和角果皮的转录组分析表明，HB、Aux/IAA、bHLH、C 2 C 2-CO-like、MYB和REM几类转录因子在灌浆期的种子和角果皮中大量表达[10]。

2 植物NAC转录因子研究

NAC是一类植物特有的转录因子家族，研究表明，其广泛参与到植物生长发育过程及各项生理活动，如胚和顶端分生组织的发育、次生根的形成、激素信号的响应、防御和抗逆、衰老等[11]。最初的NAC转录因子作为干旱响应因子被鉴定，从失水胁迫的拟南芥中克隆了9个基因，分别为RD19(RESPONSIVETODEHYDRATION26)、RD21、RD22、RD29、RD17、RD20、RD28、RD26，其中RD22和RD29的表达也可以被生长素脱落酸所诱导；通过对RD 28编码蛋白序列的分析，表明该蛋白是跨膜通道蛋白大家族中的一员[11-12]。随后越来越多的NAC家族转录因子被鉴定出来，包括矮牵牛的NAM和拟南芥ATAF 1/2和CUC 2 三个蛋白，NAC家族转录因子的命名也是由三个蛋白的首字母组成[12]。随着植物基因组学的发展，NAC转录因子在全基因组水平上的鉴定和分析在多个植物物种中完成，到目前为止，拟南芥中鉴定到117条，水稻中鉴定到151条[13]，大白菜中鉴定到204条[14]，木薯中鉴定到96条[15]，桑树中鉴定到79条[16]，西瓜中鉴定到82条[17]，玉米中鉴定到128条[18]，土豆中鉴定到110条[19]，苹果中鉴定到256条[20]，葡萄中鉴定到71条[21]，还有一些其他物种[22-23]，这些物种中的NAC家族转录因子得到了广泛的鉴定和系统的分析，包括其结构、保守模体、进化关系、表达模式等。Nakashima等[12]对拟南芥、水稻、石松和苔藓4个物种中的大多数NAC基因进行了的系统发育分析，根据保守氨基酸和NA结构域的分析，4个物种中的NAC基因被广泛地分为六大类(图2 A)。同一大类中的NAC基因功能相近，如许多胁迫响应的NAC基因都归属于SNAC(Sress-responsive NAC)大类。NAC家族参与胁迫响应报道最为多见，SNAC大类基因又被细分为SNAC-A，SNAC-B，和SNAC-C三类(图2 B)，其中拟南芥和水稻的SNAC基因集中在SNAC-A和SNAC-B两类中，石松和苔藓的SNAC基因集中在SNAC-C类中。以上研究表明，六大类NAC转录因子在很早的时期就已经存在(至少在古老的低等植物苔藓中)，同时，SNAC-A和SNAC-B两类NAC转录因子的分化发生在石松类植物和其他维管植物的分化之后，但是在单子叶和双子叶植物的分化之前。

图1 拟南芥种子发育示意图(图片引自Le等，2010)

NAC家族蛋白的氮端含有一个高度同源的区域，即与DNA结合的NAC结构域，该结构域长约150个氨基酸，含有5个保守区域(A-E)。利用X射线晶体学研究了拟南芥ANAC 019蛋白NAC结构域的结构，发现NAC结构域缺少经典的螺旋-转角-螺旋模体，多了一个新的由一些螺旋状元素包裹一个扭曲的β片层组成的TF折叠模体；同时，2个NAC结构域可以形成一个有功能的二聚体结构[11]。水稻中一个响应胁迫的NAC蛋白(SNAC 1)的结构也被鉴定了出来，SNAC 1的NAC结构域的结构与拟南芥ANAC 019的结构相似，并且也是形成二聚体起作用[24]。此外，氮端的NAM结构域还含有一个核定位信号，NAC家族蛋白碳端区域是高度变异的，含有转录激活域，有些NAC蛋白碳端区域含有蛋白结合活性的模体，而另一些NAC蛋白碳端区域含有跨膜模体[11]。

注：A为NAC家族蛋白的系统发育关系示意图；B为SNAC亚家族的系统发育树。图2 拟南芥、水稻、石松和苔藓四种植物中NAC结构域的系统发育树。(图片引自Nakashima 等，2012)

3 NAC转录因子调控种子发育过程

通过基因表达分析，发现NAC转录因子参与调控植物花发育、响应激素信号、响应生物和非生物胁迫信号、响应光信号、细胞程序化死亡和衰老等[11]。植物NAC转录因子调控种子发育和籽粒灌浆过程在以小麦和水稻为代表的多种植物中可见报道。小麦NAM家族中多个基因影响种子谷粒蛋白含量，从野生二粒小麦Gpc-B 1数量性状位点克隆到一个NAC家族转录因子TtNAM-B 1，通过RNA 干扰技术沉默TtNAM-B1及其同源基因TtNAM-A1和TtNAM-B2后，与对照相比,干扰株系延缓衰老3周，并且种子蛋白、铁、锌含量减少了30%左右，表明NAM基因参与调节小麦衰老，有利于提高种子蛋白、铁、锌含量；随后普通小麦中NAM同源基因也被验证具有相似作用[25]。分别在16个小麦及小麦近源种中克隆出NAM-B1基因，对其序列进行分析,发现NAM-B1基因SNP位点变异与谷粒蛋白含量存在一定的相关性：在一个NAM-B1碱基突变提前形成终止密码子,产生无义氨基酸的材料中，谷粒蛋白含量最低[26]。对TtNAM-B1基因的过表达和干扰株系进行转录组学分析，筛选到619个受该基因调控的下游基因，其中包括转运蛋白、激素调节基因、转录因子等[4]。最近，TtNAM-B1的同源基因NAM-G1也被发现具有相似的功能，可以增加谷粒蛋白含量；另一个同源基因TaNAC-S在小麦中过表达后使谷粒中N含量增加[27]。NAM基因在中国春小麦的不同组织中均有表达，其中TaNAM-D1在籽粒中的表达丰度最高[28]。

水稻种子中NAC转录因子影响水稻的抗逆性、谷粒灌浆及产量[29-30]。OsNAC5基因在灌浆期的水稻旗叶中上调表达，参与了营养物质从绿色叶片到种子的转运。OSNAC9和OsNAC10两个基因可以改变水稻的根系结构，增强抗旱性，进而提高产量。ONAC023基因在受粉后3 d和7 d的水稻种子中特异表达，以其为诱饵通过酵母双杂交技术，调取到21个与之结合的蛋白，其中有2个谷蛋白编码基因。

其它物种中，NAC家族转录因子与种子发育的关系也有报道。通过转录组学分析鉴定在玉米胚乳中表达的NAC家族转录因子，其中APN-1在授粉后5 d的种子中大量表达，并在授粉后20 d的种子中达到最大值；对其上游启动子序列进行分析，发现其中含有胚乳特异、ABA和GA响应的顺式作用元件；将APN-1上游启动子序列连接GUS基因进行瞬时表达，发现该基因只在胚乳的糊粉层中表达，表明其可能调控胚乳的发育[8]。从大豆中克隆了6个NAC转录因子，均由3个外显子和2个内含子组成，均含有保守的NAM结构域；对其表达模式进行分析，表明6个NAC基因先随着种子发育表达量逐渐增加，在30～35 d的大豆种子中最高，随后逐渐降低；组织特异性分析表明，GmNAC2 和GmNAC5两个基因在灌浆期的种子中表达丰度最高[31]。

4 结论和展望

种子发育是植物重要的生长过程之一，植物特有的NAC家族转录因子在这一过程中起重要调控作用。小麦NAM家族基因的表达参与谷粒蛋白含量、植株衰老、铁、锌和氮含量的调控；水稻NAC转录因子调控水稻的抗逆性、谷粒灌浆，最终影响产量；玉米、大豆等其他物种中NAC家族转录因子在种子中存在组织特异性表达。与NAC家族转录因子参与植物抗逆性相比，其调控种子发育的研究相对较少，通过反向遗传学、基因组学和蛋白质组学等方式鉴定更多与种子发育相关的NAC转录因子十分迫切。同时，由于一些NAC转录因子可能在植物的生长发育过程中有多种作用，往往不仅仅只调控一个单一的生长发育过程，也存在着多个NAC转录因子调控同一生长发育过程的情况，因此研究一个NAC转录因子调控多个生长发育过程或多个NAC转录因子调控同一生长发育过程的调控网络十分必要。

[1]黄娟,陈庆富,邓娇,等.植物种子发育相关转录因子研究进展[J].贵州师范学院学报,2016(12):48-53.

[2]Le BH,Cheng C,Bui A Q,et al.Global analysis of gene activity during Arabidopsis seed development and identification of seed-specific transcription factors[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2010,107(18):8 063-8 070.

[3]Jiang S Y,Ramachandran S.Functional genomics of rice pollen and seed development by genome-wide transcript profiling and Ds insertion mutagenesis[J].Int J Biol Sci,2010,7(1):28-40.

[4]Cantu D,Pearce S P,Distelfeld A,et al.Effect of the down-regulation of the high Grain Protein Content (GPC) genes on the wheat transcriptome during monocarpic senescence[J].BMC Genomics,2011(12):492.

[5]Jones S I,Gonzalez D O,Vodkin L O.Flux of transcript patterns during soybean seed development[J].BMC Genomics,2010(11):136.

[6]Basnet R K,Moreno-Pachon N,Lin K,et al.Genome-wide analysis of coordinated transcript abundance during seed development in different Brassica rapa morphotypes[J].BMC Genomics,2013,14:840.

[7]Kohl S,Hollmann J,Erban A,et al.Metabolic and transcriptional transitions in barley glumes reveal a role as transitory resource buffers during endosperm filling[J].J Exp Bot,2015,66(5):1 397-1 411.

[8]Verza N C,Figueira T R S,Sousa S M,et al.Transcription factor profiling identifies an aleurone-preferred NAC family member involved in maize seed development[J].Annals of Applied Biology,2011,158(1):115-129.

[9]谢億.调控玉米种子发育关键转录因子的筛选[D].四川农业大学,2013.

[10]柳寒.油菜灌浆期种子和角果皮基因表达差异及相关基因的功能分析[D].华中农业大学,2015.

[11]康桂娟,曾日中,聂智毅,等.植物NAC转录因子的研究进展[J].生物技术通报,2012(11):21-26.

[12]Nakashima K,Takasaki H,Mizoi J,et al.NAC transcription factors in plant abiotic stress responses[J].Biochim Biophys Acta,2012,1819(2):97-103.

[13]Nuruzzaman M,Manimekalai R,Sharoni A M,et al.Genome-wide analysis of NAC transcription factor family in rice[J].Gene,2010,465(1-2):30-44.

[14]Liu T,Song X,Duan W,et al.Genome-Wide Analysis and Expression Patterns of NAC Transcription Factor Family Under Different Developmental Stages and Abiotic Stresses in Chinese Cabbage[J].Plant Molecular Biology Reporter,2014,32(5):1 041-1 056.

[15]Hu W,Wei Y,Xia Z,et al.Genome-Wide Identification and Expression Analysis of the NAC Transcription Factor Family in Cassava[J].PLoS One,2015,10(8):e 136993.

[16]Baranwal V K,Khurana P.Genome-wide analysis,expression dynamics and varietal comparison of NAC gene family at various developmental stages in Morus notabilis[J].Mol Genet Genomics,2016,291(3):1 305-1 317.

[17]Wei S,Gao L,Zhang Y,et al.Genome-wide investigation of the NAC transcription factor family in melon (CucumismeloL.) and their expression analysis under salt stress[J].Plant Cell Rep,2016,35(9):1 827-1 839.

[18]Shiriga K,Sharma R,Kumar K,et al.Genome-wide identification and expression pattern of drought-responsive members of the NAC family in maize[J].Meta Gene,2014(2):407-417.

[19]Singh A K,Sharma V,Pal A K,et al.Genome-wide organization and expression profiling of the NAC transcription factor family in potato(SolanumtuberosumL.)[J].DNA Res,2013,20(4):403-423.

[20]刘更森,张演义,戴洪义,等.苹果NAC转录因子家族生物信息学分析[J].江苏农业科学,2012(6):14-23.

[21]李成慧,蔡斌.葡萄NAC转录因子家族全基因组分析[J].上海农业学报,2013(6):7-13.

[22]罗朝兵.青杆PwNAC1及其拟南芥同源基因ANAC018转录活性及功能分析[D].北京林业大学,2016.

[23]朱乾坤.AtNAC 1转录因子的分子建模和铁皮石斛NAC家族基因的克隆及表达分析[D].西南交通大学,2014.

[24]Chen Q,Wang Q,Xiong L,et al.A structural view of the conserved domain of rice stress-responsive NAC 1[J].Protein Cell,2011,2(1):55-63.

[25]Uauy C,Distelfeld A,Fahima T,et al.A NAC Gene regulating senescence improves grain protein,zinc,and iron content in wheat[J].Science,2006,314(5 803):1 298-1 301.

[26]Jamar C,Loffet F,Frettinger P,et al.NAM-1gene polymorphism and grain protein content in Hordeum[J].J Plant Physiol,2010,167(6):497-501.

[27]Zhao D,Derkx A P,Liu D C,et al.Overexpression of a NAC transcription factor delays leaf senescence and increases grain nitrogen concentration in wheat[J].Plant Biol (Stuttg),2015,17(4):904-913.

[28]吴丹,董剑,要燕杰,等.小麦中国春NAM转录因子Gpc-1和Gpc-2灌浆期时空表达模式分析[J].中国农业科学,2015(07):1 262-1 276.

[29]唐立群,黄世文,侯雨萱.水稻种子酵母双杂交体系的构建及种子特异表达蛋白ONAC 023互作蛋白的鉴定[J].江苏农业科学,2014(09):16-20.

[30]Redillas M C,Jeong J S,Kim Y S,et al.The overexpression of OsNAC9 alters the root architecture of rice plants enhancing drought resistance and grain yield under field conditions[J].Plant Biotechnol J,2012,10(7):792-805.

[31]孟庆长.大豆GmNAC和GmLFY转录因子编码基因的克隆、鉴定和种子性状的QTL定位研究[D].南京农业大学,2006.