糖尿病皮肤溃疡干细胞治疗及作用机制的研究进展*

石秀君， 聂绪强, 2△， 赵久凤， 陈 宇

(遵义医科大学 1药学院， 2院士工作站， 贵州 遵义 563000)

在我国，糖尿病患者的数量逐年增多，过去20年里，我国糖尿病患病人数呈爆炸式增长。据估计，截止到2017年全球患病人数约为4.25亿，预计到2045年将达到6.29亿。我国是全球糖尿病人数最多的国家，2017年糖尿病人数为1.14亿，预计到2045年将达到 1.5亿左右。糖尿病皮肤溃疡(diabetic cutaneous ulcers，DCU)是指糖尿病患者由于长期血糖控制不良，进而引起神经病变及不同程度的各种末梢血管病变而导致下肢感染、溃疡形成和/或深部组织的破坏。调查显示，大约60%的非创伤性小腿截肢是由糖尿病引起的，DCU是糖尿病患者致死致残的严重并发症之一，严重影响患者的生活质量。传统的药物治疗、血管搭桥术、经皮内血管形成手术和支架置入术等方法都有其局限性[1]。由于干细胞具有高度分化和增殖潜能，其在糖尿病治疗中的作用逐渐凸显出来，目前干细胞移植治疗DCU已经部分应用于临床，但不同类型干细胞对DCU的治疗作用、具体的机制及临床有效性等需要进一步探讨。本文就此对近年来国内外不同来源干细胞治疗DCU的作用及机制进行综述。

1 DCU的发病机制

DCU是糖尿病患者由于神经血管病变导致微循环障碍而发生的溃疡和坏疽，是神经病变、血管病变和感染共同作用的结果，一种病变引起另一种病变，形成恶性循环，导致病情加重。DCU分为神经性和缺血性，也有神经缺血混合性，感染是最后共同的途径。对于糖尿病患者，由于机体长期处于高糖环境中，导致内源性一氧化氮(nitric oxide，NO)不足，在高糖环境下白细胞功能缺陷，引起免疫应答不足。同时，新生血管缺乏，创面顽固性细菌感染，皮肤真皮层细胞新生刺激或分化不良都是造成DCU难以愈合的原因[2]。

1.1神经病变 随着糖尿病发病率的上升，周围神经病变等糖尿病并发症的发生率也相应增加。据估计，约50%的糖尿病患者由于疾病持续时间长和未得到有效控制而发展成神经病变。糖尿病周围神经病变(diabetic peripheral neuropathies，DPN)是糖尿病最常见的并发症，也是截肢的主要原因[3]。DPN是糖尿病患者神经功能紊乱引起的疾病，伴有疼痛的远端对称多神经病变(distal symmetrical polyneuropathy，DSPN)约占糖尿病患者的20%；糖尿病自主神经病变(diabetic autonomic neuropathy，DAN) 是DPN最常见的表现，主要影响血管的收缩和舒张功能，皮肤血流的自我调节能力降低、汗液脂腺分泌减少，导致皮肤干燥，造成局部感染[4]。DPN患者对皮肤损伤的敏感性减低，感觉迟钝甚至丧失，患者在活动过程中易导致皮肤损伤，溃疡加深，最后导致组织损伤，给患者的生活甚至休息带来不良影响[5]。运动神经病变主要是引起糖尿病足患者足部腓肠肌群神经支配不平衡，导致足部变形，在不合适的鞋袜作用下容易引起足部损伤，易发生细菌入侵[6]。

1.2血管病变 糖尿病导致的血管病变常累及动脉、静脉和毛细血管，造成管腔狭窄、粥样硬化、血管闭塞而引起溃疡。糖尿病血管病变分为大血管病变和微血管病变。大血管病变主要引起动脉粥样硬化，形成斑块，血管壁增厚，血管腔变窄甚至堵塞，导致供血不足，形成缺血性溃疡[7]；微血管病变主要表现为微血管基膜增厚，舒缩功能紊乱，特别是在神经病变的作用下，造成组织缺血，肢体远端血液循环障碍，导致局部感染[8]。血管病变引起的微血管和微循环不同程度的障碍是造成远端缺血和组织损伤的主要原因。糖尿病患者代谢发生紊乱，导致血液的理化性质改变，出现持续的高黏和高凝状态。机体长期的高血糖状态，会导致上皮功能障碍和白细胞功能缺陷，造成内源性NO减少，导致免疫功能障碍，免疫应答不足，在诸多因素联合作用下使患者病情加重[9]。

1.3感染性糖尿病足 患者由于神经病变和血管病变极易感染，而感染会导致患者的病情加重。 糖尿病患者免疫功能异常，对感染反应减弱，一般不会出现红肿等感染迹象，不易察觉，加之神经病变和血循环障碍，病情将进一步恶化，导致截肢甚至危及生命。

2 干细胞治疗DCU的研究进展

干细胞是一类具有极强的自我更新和自我复制能力的细胞，具有多向分化潜能，在特定的条件下能分化为各种细胞、组织和器官，被医学界称之为“万能细胞”。根据干细胞所处的发育阶段可分为胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)和成体干细胞(adult stem cells，ASCs)，ESCs具有全能性，能分化成体内各种组织和器官；而ASCs分化潜能较弱，只能分化成为特定的细胞组织[10]。

传统治疗糖尿病足的手段主要包括内科药物治疗、外科手术治疗和介入治疗。由动脉闭塞引起下肢缺血的患者，血管病变严重，药物保守治疗已不再适用，需要进行手术治疗或介入治疗。但糖尿病患者大多年老体弱，且往往伴随其它疾病，也有一部分患者由于缺乏远端动脉流出道，不具备手术搭桥和介入疗法的条件。由于近年来干细胞分离和培养技术的发展，干细胞治疗作为一种新型疗法，为这类糖尿病患者带来了希望。通过干细胞的方法治疗DCU，主要是由于干细胞能分化成血管内皮细胞(vascular endothelial cells，VECs)和平滑肌细胞(smooth muscle cells，SMCs)，形成新的毛细血管，同时干细胞分泌的多种细胞因子可以促进组织修复，改善和恢复下肢血流，促进新生血管生成，达到治疗DCU的目的。

2.1ESCs与DCU的治疗 ESCs是处于胚胎发育早期的细胞，无论在体内体外都能被诱导分化成为各种类型的细胞。目前的科学研究中，主要是将ESCs诱导分化成为胰岛素分泌细胞，通过改善糖尿病患者胰岛素分泌不足的情况而治疗DCU，同时胎盘干细胞分化成熟度低、增殖能力强，对于混合性原因引起的DCU有很好的治疗作用[10]。黄锦桃等[11]在体外培养ESCs并诱导其分化为表皮干细胞，将带有核荧光标记的ESCs源性表皮干细胞以生物膜为载体，覆盖于小鼠皮肤表面全层皮肤缺损处，术后取材，由HE染色，苏丹Ⅲ染色以及免疫组化双标发现，ESCs源性表皮干细胞在全层皮肤缺损处有分化为汗腺样、表皮样、毛囊样和皮脂腺样结构的潜能。在含有特定生长因子的特定培养基中，ESCs可以分化为角质化细胞，这些角质化细胞可以在培养过程中形成多层表皮，成为生物工程皮肤的关键细胞类型[12]。ESCs具有多能性和无限扩增能力，但由于分化难以控制易导致畸形，同时，提取分离ESCs要破坏胚胎，使其在伦理学和法律等方面受到限制，制约了ESCs的研究发展。

2.2间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)与DCU的治疗 MSCs是来源于中胚层的细胞，具有多向分化潜能，于20世纪60年代首次从骨髓中被鉴定，在骨髓中含量最丰富，也存在于脐血、外周血和脂肪等部位。间充质干细胞能旁分泌血管生成素1和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等促进血管生成的血管生长因子，还能促进细胞向创伤部位迁移，形成肉芽组织，此外，间充质干细胞还可促进角质细胞参与伤口表皮的形成，对DCU的愈合有很好的治疗作用[13]。

2.2.1脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSCs)与DCU的治疗 UC-MSCs是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它能分化成许多种组织细胞，具有广阔的临床应用前景[14]。脐带干细胞原始，不引起社会伦理问题，糖尿病皮肤溃疡局部移植UC-MSCs，促进创面干燥、结痂，组织再生和愈合。何晏清等[15]以100例2型糖尿病皮肤溃疡患者，随机分为观察组和对照组，观察组应用UC-MSCs移植治疗，对照组给予常规处理，可以发现观察组的愈合效率明显高于正常组。徐海环等[16]在Sprague-Dawley 大鼠建立DCU模型后，用脐带间充质干细胞上清提取物作用于溃疡处，发现与模型组和对照组比较，有效降低肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的表达及提高VEGF的表达水平。有临床研究发现，53例糖尿病足溃疡患者给予血管形成术介入治疗后，25例患者作为对照组，28例患者在介入治疗后进行人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUCMSCs)移植，3个月后随访发现，实验组患者的伤口愈合情况、踝肱指数的压力和经皮氧压力都较对照组更好，且新生血管数较对照组更多，无不良反应[13]。动物实验表明，SD大鼠DCU模型中给予HUCMSCs移植治疗，结果显示，细胞角蛋白K19表达量增加，溃疡愈合情况较对照组好，胶原表达增多，细胞上皮化[17]。

2.2.2脐血间充质干细胞(umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells，UCB-MSCs)与DCU的治疗 UCB-MSCs具有相似的形态学、细胞表面抗原，以及分化为骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs)和UC-MSCs的潜力，有较短的倍增时间，较长的存活时间和较好的抗炎活性。Xia等[14]用UCB-MSCs治疗糖尿病足大鼠，治疗组大鼠血液中神经因子(nerve growth factor，NGF)表达增高，股神经的传导速度显著恢复，实验结果表明，UCB-MSCs通过促进大鼠糖尿病皮肤溃疡处血管生成和NGF的表达促进创伤愈合。You等[18]发现，在体外培养人体UCB-MSCs、糖尿病及正常人皮肤成纤维细胞，UCB-MSCs产生的纤维母细胞生长因子和内皮细胞生长因子的能力均优于2个成纤维细胞组，UCB-MSCs胶原合成的能力优于糖尿病成纤维细胞组但弱于正常成纤维细胞组，提示比起胶原合成，UCB-MSCs在糖尿病创伤愈合方面具有更大潜力，尤其在血管生成中发挥重要作用。但由于隐私和伦理问题，并且UCB-MSCs保存费用昂贵，所以UCB-MSCs在治疗糖尿病皮肤溃疡中并未得到广泛应用。

2.2.3BM-MSCs与DCU的治疗 骨髓是获得间充质干细胞最常见的来源之一，BM-MSCs是存在于骨髓中的非造血干细胞，对造血干细胞具有机械支撑作用，可以分泌多种生长因子支持造血干细胞造血，还可以分化成骨细胞、表皮细胞和神经细胞等多种类型的细胞，并可以诱导分化为胰腺分泌细胞，应用前景广泛。有文献表明，BM-MSCs可以分化为真皮层的成纤维细胞，或分泌多种细胞因子，通过促进胶原合成，促进创伤愈合[19]。BM-MSCs没有免疫限制，不会刺激同种异体反应，可以促进细胞迁徙，促进血管生成，并促进旁分泌加速创伤愈合。Iwamoto等[20]证实，通过全身注射粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)，从骨髓中动员的自体干细胞可以改善临床患者的伤口愈合情况并发现可以促进小鼠伤口愈合，可能是由于G-CSF促进骨髓源性干细胞动员和迁移到伤口部位，并改善肉芽组织，以增强上皮化。自体干细胞移植可以显著改善临床参数，包括减少伤口大小，维持正常肝和肾功能，腿部灌注也得到充分的改善，减少了主要的截肢手术。故有研究发现将自体移植物与BM-MSCs结合，发现可减少伤口的大小，增加皮肤的血管舒张和厚度[21]。Amini等[22]在1型糖尿病溃疡大鼠模型给予药物治疗，RT-PCR结果显示BM-MSCs治疗组的碱性成纤维细胞生长因子1α(basic fibroblast growth factor，bFGF)、低氧诱导因子(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)和基质细胞衍生因子1α(stromal cell-derived factor-1α，SDF-1α)表达水平均高于安慰剂组，BM-MSCs联合光生物调节较单独治疗对1型糖尿病溃疡大鼠具有更好的作用。

2.2.4脂肪间充质干细胞(adipose mesenchymal stem cells，A-MSCs)与DCU的治疗 A-MSCs是由Feng等[23]首次从人脂肪组织中分离出的脂肪干细胞，A-MSCs 与BM-MSCs形态相似，来源广泛，能大量获取。A-MSCs可分化为内皮细胞和上皮细胞，并有分泌多种细胞因子的能力。有研究表明，在DCU小鼠模型中，与磷酸盐缓冲盐处理的相比，用微粒化的脂肪细胞基质治疗的皮肤伤口明显加速愈合。微粒化的脂肪细胞基质在缺血性糖尿病溃疡中有加速创伤愈合的潜力，可能提供一种简单、安全、微创的组织修复和恢复的方法。Seo等[24]在DCU小鼠模型中发现，给予A-MSCs和醋酸艾塞那肽联合治疗，可促进内皮细胞的迁移、侵袭、增殖，促进创伤愈合。

2.3表皮干细胞(epidermal stem cells)与DCU的治疗 表皮干细胞作为皮肤组合特异性细胞，不仅维持着表皮日常的新陈代谢，且积极参与皮损后的修复。表皮干细胞来源于胚胎的外胚层，在胎儿时期主要位于初级表皮层，成人时位于表皮基底层和毛囊凸起部位，小鼠皮脂腺底部也发现表皮干细胞的存在[25]。表皮干细胞的位置相对稳定，位于毛囊隆突处，可用表皮干细胞特征标志物K19进行检测。在皮肤创伤愈合的过程中，创面再上皮化是创伤愈合的标志。有研究表明，创面的表皮细胞可去分化成表皮干细胞，在机体的微环境的诱导下，表皮干细胞可再分化成表皮细胞和毛囊、汗腺等皮肤附属器促进皮肤创伤愈合[26]。

2.4单个核细胞(mononuclear cells，MNCs)与DCU的治疗 MNCs包括骨髓单个核细胞(bone marrow mononuclear cells，BM-MNCs)和外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PB-MNCs)。BM-MNCs是指骨髓中具有单个细胞核的细胞的总称，是具有自我更新和分化能力的原始骨髓细胞；PB-MNCs是外周血中具有单个细胞核的细胞，主要包括淋巴细胞和单核细胞。黄平平等[27]首次报道了动员自体外周血干细胞移植治疗下肢缺血的临床研究，1例下肢闭塞性动脉硬化(arteriosclerosis obliterans)患者接受自体外周血干细胞移植后，疼痛，间歇性跛行，患肢冷感和溃疡等明显好转，移植一个月后，末梢血流波幅和激光多普勒扫描血流灌注量较移植前显著改善，且患者未出现移植相关的并发症和不良反应。El-Mesalamy等[28]发现，在大鼠模型中，用人脐带血单个核细胞(human umbilical cord blood mononuclear cells，HUCB-MNCs)和人脐带血透析液(human umbilical cord blood haemodialysate，HUCB-HD)治疗DCU会导致伤口收缩，增加过氧化氢酶、NO、血小板数、体重和羟脯氨酸，降低葡萄糖和丙二醛的含量。Trignano等[29]报道了一位61岁的糖尿病男性患者，进行MNCs移植治疗之后，踝关节神经传导速度改善，患者的伤口愈合明显改善；6个月后随访，无复发迹象。

2.5内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)与DCU的治疗 EPCs是血管内皮细胞的前体细胞, 是骨髓产生的原始细胞，能定向向缺血部位趋化，通过自身的分化、增殖, 形成新生血管，从而改善肢体缺血状态。Dubsky等[30]在50例糖尿病患者中随机挑选28例糖尿病患者，17例用BM-MNCs进行治疗，11例用外周血内皮祖细胞(peripheral blood endothelial progenitor cells，PB-EPCs)治疗，22例糖尿病患者选为对照组，采用保守治疗。结果显示6个月后，在2个细胞治疗组，经皮氧气压力比基线显著增加，这2组之间无显著差异；细胞治疗组截肢率显著降低，2个细胞治疗组无显著差异；BM-MNCs和PB-EPCs组血清细胞生成因子无明显差异。研究说明与保守治疗相比，BM-MNCs和PB-EPCs治疗组有明显优势，并且2种方法无明显差异。Zhao等[31]将胎儿主动脉来源的EPCs移植到DCU大鼠模型中，血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)和内皮白细胞黏附分子1(endothelial leukocyte adhesion molecule-1，ELAM-1)表达水平增高，CD133表达水平明显降低，DCU大鼠进行细胞移植治疗后，温度、血流量、血氧饱和度等都逐渐恢复，缺血性症状改善。

3 干细胞治疗DCU的机制研究

3.1Wnt信号通路在干细胞治疗DCU中的作用 Wnt/β-catenin途径是Wnt信号通路经典途径。Wnt 蛋白与细胞表面受体Frizzled和 LRP5/6 结合后活化胞质内蓬乱蛋白(Dishevelled，Dvl)，并抑制下游蛋白复合物，使 β-catenin 在细胞质内稳定存在，部分β-catenin进入核内与T细胞因子/淋巴样增强因子(T-cell factor/lymphoid enhancing factor，TCF/LEF) 相互作用，活化下游靶基因的表达[32]。张季林等[33]发现，白花檵木醇提物(ethanol extract ofLoropetalumchinensis，EELC)激活经典Wnt信号通路，促使β-catenin关键蛋白积累，进入细胞核内与转录因子结合，激活下游特异靶基因表达，促进ESCs 增殖、分化，有效地修复糖尿病溃疡皮肤创面。钟清玲等[34]发现，表皮干细胞移植可有效促进糖尿病大鼠皮肤溃疡创面愈合，且β-catenin表达增强。有研究发现，在糖尿病皮肤溃疡的糖尿病患者和小鼠中，色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor，PEDF) 表达水平增高，通过动物实验和生化指标发现PEDF导致创伤愈合延迟，由半乳糖苷染色和Western blot实验结果发现，在DCU小鼠中PEDF抑制Wnt信号通路，提示PEDF可能通过抑制Wnt信号通路延迟DCU愈合[30]。

3.2PI3k/Akt信号通路在干细胞治疗DCU中的作用 磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)具有Ser/Thr激酶活性；Akt又称蛋白激酶B (protein kinase B，PKB)，是PI3K信号通路下游的重要靶蛋白，有3个亚型，其中Akt2主要表达于胰岛素效应组织等参与胰岛素稳态调节[35]。在膜外刺激下，酪氨酸蛋白激酶激活，引起胰岛素受体底物(insulin receptor substrate，IRS)磷酸化并催化质膜上的磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol，PI)磷酸化，活化Akt，活化的Akt从质膜转移至胞质、线粒体和胞核内，引起底物的磷酸化，信号传导的级联反应发生[35-38]。 PI3K/Akt 信号通路的激活可促进内皮细胞增殖和迁移，发挥抗凋亡作用。有研究发现，通心络联合外周血间充质干细胞移植可以通过调节 PI3K/Akt 信号通路，上调p-Akt、抑制p-GSK-3β的蛋白水平，进而上调 cyclin D1 表达，促进内皮细胞增殖和分化，从而促进糖尿病足大鼠的新生血管形成。体外培养人脐静脉血管内皮细胞，构建重组腺病毒载体以提高神经导向蛋白netrin-1表达量，netrin-1上调恢复了受损的PI3K/Akt-eNOS信号通路，并通过PI3K/Akt-eNOS信号通路改善HUVECs功能障碍[39]。研究发现在小鼠糖尿病皮肤溃疡模型中，用三七皂苷Ft1进行处理后，Ft1通过PI3K/Akt/mTOR信号通路促进创伤愈合。此外，体外培养成纤维细胞并用三七皂苷Ft1处理后发现Ft1通过PI3K/Akt/mTOR信号通路促进成纤维细胞增殖[40]。

3.3丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路在干细胞治疗DCU中的作用 MAPK在细胞增殖，细胞分化、发育、凋亡和恶化中扮演重要作用[41]。MAPK通路可分为4个传导路线：ERK、p38 MAPK、JNK和ERK5，又通过MAPK、MAPK激酶(MAPK kinase，MEK或MKK)及MAPK激酶的激酶(MAPK kinase，MAPKKK)3种激酶的级联反应将胞外刺激传递到胞内。有研究表明，MAPK信号的级联反应可能抑制IRS磷酸化，导致胰岛素的抵抗。MAPK信号通路的激活抑制了GLUT4的表达，导致葡萄糖转运减少[42]。国内外研究发现，高糖可使培养的内皮细胞p38 MAPK活性升高，并促进下游基因表达[43]。p38 MAPK激活可使平滑肌增大，内皮细胞紊乱，加速粥样化的形成。张超等[44]在Wister大鼠模型中发现，四妙勇安汤能改善糖尿病下肢缺血血运重建过程，促进血管新生，可能是通过促进Akt表达，抑制p38 MAPK表达来实现。Choi等[42]用石花菜提取物对C57BL/KsJ-db/db小鼠进行处理，发现其通过活化胰岛素受体、PI3K和上调GLUT4来激活胰岛素信号通路，与此同时，还发现提取物处理组小鼠MAPK信号通路下调。有研究表明，体外培养HUVECs 并用血竭素处理后发现，血竭素主要通过 Ras/MAPK信号通路促进HUVECs 增殖及迁移并提高其管生成能力[45]。

4 展望

目前临床及临床前的数据证明干细胞移植治疗DCU是一种有效的方法，但仍然面临许多挑战：(1)干细胞的获得和纯度控制；(2)到底该使用哪一类干细胞为最优来源；(3)哪一类临床前的动物模型与临床差距最小；(4)缺乏相应的质量检测标准和方法；(5)如何确定干细胞的最佳移植浓度、移植方法和移植时间；(6)干细胞的长期生存能力和治疗功效；(7)长期应用是否会出现增殖难以控制而致瘤等。未来，微粒化的干细胞或选择合适的移植物载体(如水凝胶、生物支架等)更有利于干细胞发挥治疗作用；同时，由于不同DCU患者产生溃疡的机制不尽相同，从机制针对性地进行干细胞移植治疗能更有效地治疗DCU；尽管自体干细胞是最常用的干细胞类型，但未来的研究可能会探索多能干细胞以及同种异体甚至异种细胞的使用；再者，干细胞联合其它疗法，并进行适当的个体化精准治疗，能更有效缓解及解除患者病痛。总之，如何找到合适的载体和移植途径及基质设计和配置对干细胞功能的影响，如何快速鉴别DCU患者溃疡产生的具体机制，怎样保证干细胞移植发挥最大作用，怎样进行联合治疗是未来干细胞治疗DCU临床及临床前研究亟待解决的问题。