嵌合抗原受体基因修饰的NK细胞治疗实体瘤的研究进展①

童晨曦 宋银宏

(三峡大学医学院病原与免疫学系 三峡大学感染与炎症损伤研究所，宜昌443002)

近年来，免疫治疗恶性肿瘤取得了长足的进步，多种免疫治疗方式对不同的恶性肿瘤都有良好的治疗效果[1]。嵌合抗原受体基因修饰的T细胞(Chimeric antigen receptor-modified T,CAR-T)疗法是一种很有前景的治疗性疗法，在血液肿瘤领域的应用取得了很好的疗效[2]，识别CD19靶点的CAR-T细胞可以治愈B淋巴细胞白血病和淋巴瘤。2017年8月30日，诺华公司的CTL019获得FDA批准上市用于治疗急性淋巴细胞白血病[3]。CAR-T在血液肿瘤领域成功应用在于其并不依赖通常会发生肿瘤耐受的常规治疗途径。但是，此疗法也有不足之处：输注后可能出现副反应如细胞因子释放综合征(Cytokine release syndrome,CRS)，特征为高热、低血压、凝血障碍、神经毒性和严重病例死亡；还可能出现脱靶效应，造成患者正常组织的损伤；CAR-T细胞的制备通常也需要患者自体细胞，因为同种异体T细胞会引起移植物抗宿主反应(Graft-versus-host disease,GVHD)[4]。另外，CAR-T疗法在实体瘤中的治疗效果并不像治疗血液肿瘤那么显著。利用较成熟的CAR技术修饰其他效应细胞来治疗肿瘤，同样是具有基础研究和临床意义的。NK细胞被认为是更有潜力用CAR模式构建来治疗恶性肿瘤的[5]，特别是在治疗实体瘤方面，可能比构建的CAR-T细胞的治疗效果更理想。已经有大量的实验在研究如何构建特异性高且有效的CAR-NK，并明确CAR-NK对各种恶性肿瘤的治疗作用。现将CAR-NK疗法的发展及其治疗实体瘤方面的一些研究进展进行一个综述。

1 CAR-NK细胞免疫疗法

NK细胞是先天免疫系统的重要组成部分，在宿主抗肿瘤免疫中发挥着重要作用。与CAR免疫疗法中靶向的T细胞相比，NK细胞具有许多优点。例如，异基因NK细胞可以用作效应细胞，不需要HLA匹配，也不会发生GVHD[6]。CAR-NK细胞可能比CAR-T细胞更安全，因为它们通常不会诱导CRS，也更少导致脱靶效应[6]。此外，NK细胞可以从不同来源产生，如外周血、脐带血(Umbilical cord blood,UCB)[7]、胚胎干细胞(human embryonic stem cell，hESC)、诱导性多能干细胞(induced pluripotent cells,iPS)，甚至NK-92细胞系[8]。通常，嵌合抗原受体(CAR)包含三个结构域：胞外结构域、跨膜结构域以及胞内结构域。胞外结构域是单链抗体片段(scFv)，其通过特异性结合肿瘤相关抗原(Tumor associated antigen,TAA)将效应细胞重定向至肿瘤细胞的靶部分；胞内结构域通常是包含CD3ζ链和共刺激因子如CD28和4-1BB(CD137)的信号转导结构域。目前CAR分四代：第一代的细胞内结构域仅含有CD3ζ链；第二代含有CD3ζ链和共刺激分子，如CD28、4-1BB、CD134(OX40)或者ICOS；第三代包含一个CD3ζ链和两个或多个不同的共刺激分子；四代的CAR则加入了细胞因子或共刺激配体[9]，这样能够使改造过的效应细胞的扩增活性和寿命有所提升。 CAR-NK继承了CAR-T细胞构建的设计思路和基本框架，同时又有一些CAR-NK独有的个性化设计。例如，选择DNAX相关蛋白12(DNAX-associated protein 12,DAP12)和DAP10作为胞内信号传导结构域，DAP12可能比CD3ζ能更好地激活NK细胞信号传导。已经有研究开发了包含自然杀伤组2，成员D(Natural killer group 2,member D,NKG2D)作为胞外域，将DAP10和CD3ζ作为关键信号分子的独特CAR构建体。NKG2D是NK细胞表面受体，其配体在广谱肿瘤中表达。这些CAR-NK细胞也表现出了对广谱的肿瘤亚型很强的细胞毒性，在急性淋巴细胞白血病、骨肉瘤、前列腺癌和横纹肌肉瘤中都有较好杀伤肿瘤效果[10]。用于NK细胞激活的最佳CAR构建体的组合还取决于肿瘤类型或靶抗原。根据不同肿瘤中过表达的抗原来设计构建特异性高的、独特的CAR构建体,对靶向特定的肿瘤细胞及增强CAR-NK的杀伤作用都会是有益处的。

2 CAR-NK治疗实体瘤的研究进展

2.1CAR-NK治疗胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GBM) GBM是一种预后不良的高度恶性脑肿瘤，目前无法治愈。治疗主要采用常规的手术切除，然后是放疗、化疗和抗血管生成。尽管采取这些治疗方法干预，但GBM患者预后仍然很差。只有1/3的GBM患者存活1年[11]。之前有研究提出人类表皮生长因子受体(human epidermal growth factor receptor-2,ErbB2/HER2)是CAR-T细胞治疗胶质母细胞瘤的潜在靶点，因为在GBM中HER2蛋白水平升高，且与不良预后有关[12]。为了研究HER2特异性CAR-NK细胞用于胶质母细胞瘤治疗的潜力，Zhang等[13]采用能在体外大量扩增的NK-92细胞系，设计出结合了HER2特异性抗体FRP5和包含CD28/CD3ζ信号传导结构域的密码子优化的第二代CAR(CAR 5.28.z)。并研究了NK-92/5.28.z细胞对体外培养的GBM细胞和GBM小鼠肿瘤模型体内治疗的有效性和特异性，结果显示这些CAR-NK细胞具有明显的抗肿瘤活性，且治疗后能诱导内源性抗肿瘤免疫。同样是关于GBM的研究，Genβler等也重新基因修饰了人NK细胞系NK-92细胞，同样是包含用于信号转导的复合CD28/CD3ζ结构域的CAR和用于细胞结合的scFv抗体片段，不同的是，它可以识别HER1、表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(Epidermal growth factor receptor variant Ⅲ,EGFRvⅢ)两种表达的抗原，Genβler等并在体外和体内针对胶质母细胞瘤的抗肿瘤活性进行了实验。结果显示，用双特异性NK细胞治疗效果优于用相应的单特异性CAR-NK细胞治疗；且治疗使GBM肿瘤模型小鼠存活的显著延长，也不会像用单特异性效应物治疗时那样诱导快速免疫逃逸，即CAR-NK细胞的双靶向降低了免疫逃逸的风险[14]。这些结果都为CAR-NK的设计和应用提供了一些思路。设计构建其他抗原的双特异性CAR-NK、CAR-NK同其他治疗肿瘤的方法的组合也值得探索。众所周知，恶性肿瘤往往不只表达单一的肿瘤相关抗原，且很难找到只在肿瘤细胞上表达的绝对特异性的抗原(Tumor specific antigen,TSA)，如果只设计针对单一的TAA的受体，难免会对正常组织产生不良反应，这种识别多种抗原的多特异性CAR-NK的设计就使治疗精准度更高，且能限制脱靶副作用。

2.2CAR-NK治疗卵巢癌 卵巢癌是全世界最致命的妇科恶性肿瘤，化疗和手术切除是目前治疗卵巢癌的主要手段。虽然化疗和手术导致肿瘤宏观的切除，但患者晚期还是极易发生死亡，最大的问题是晚期频繁的复发[15]。为了预防恶性肿瘤的复发性，Klapdor等选择了在多种实体肿瘤的肿瘤干细胞(Cancer stem cell，CSC)中表达的CSC标记CD133作为靶点，利用CAR免疫疗法来治疗卵巢癌。构建了第三代抗CD133-CAR结构，利用慢病毒载体转导至临床使用的NK-92细胞。这些工程化的NK细胞在对卵巢癌患者腹水培养的CD133阳性卵巢癌细胞系和原代卵巢癌细胞都有特异性杀伤作用。为了提高卵巢癌治疗的效果，又将化疗药物顺铂与CAR-NK细胞联合作用于体外培养的卵巢癌细胞，再进行效果评估。结果证明，在顺铂治疗后NK细胞仍然具有细胞毒性和活性，并且能导致更强的杀伤作用[16]。出现这样的结果可能与癌症干细胞的活性有关，因为癌症干细胞是具有提高化学抗性和自我更新和转移扩散能力的细胞亚群[17]。针对这些细胞进行免疫治疗可能是降低恶性肿瘤复发性风险的有效策略。在构建双特异性CAR-NK思路的基础上，也可以去尝试在双特异性CAR中组合两种CSC标记作为双激活信号(例如CD133和CD44)来共同定位肿瘤。另外，我们可以推测，一种CSC标记物和一种肿瘤相关抗原的组合也可能是一种有效果的组合方式。

2.3CAR-NK治疗乳腺癌 乳腺癌是威胁女性健康的一种常见的恶性肿瘤，随着早期检测手段和乳腺癌治疗技术的改进发展已经使患者生存率有所提升，但是乳腺癌仍然是女性癌症相关死亡的常见原因[18，19]。想要彻底攻克乳腺癌还需要研究更有针对性的治疗方法。在此前针对乳腺癌的治疗研究中，特异性靶向HER3/HER4、TEM8/ANTXR1等相关抗原的CAR-T细胞就展现出了对不同类型乳腺癌的持续抑制效果。但是，这些研究对乳腺癌转移的疗效并不明确，而快速转移往往是影响患者预后生存率的重要因素[20,21]。成功治愈实体瘤有很多的挑战，特别是对于转移性的实体瘤。Chen等用CAR修饰的NK细胞和溶瘤性单纯疱疹病毒(oHSV)的组合对乳腺癌脑转移进行治疗。首先是用第二代HER1-CAR修饰的NK-92细胞系在体外和乳腺癌颅内小鼠模型中测试其治疗效果，因为脑转移在乳腺癌中十分常见，可能与预后不良有关。NK-92细胞的早期输注可以快速控制肿瘤生长并减少大脑中的肿瘤大小，让神经系统症状和颅内高压快速缓解。之后使用oHSV能够杀死残余的癌细胞并持续诱导对癌细胞的免疫应答[22]。在治疗实体瘤时，CAR-NK在体内寿命比较短，较少引起CRS或者脱靶效应[23]。但从另一方面来思考，它们在体内很短的持续时间可能限制其对肿瘤细胞杀伤功效，这也有可能是肿瘤以后会发生转移或者复发的隐患。可以尝试在构建特异抗原的CAR-NK前对NK细胞进行改造，使其具有免疫记忆功能，以使其具有更持续的杀伤活性。

3 不足及展望

虽然CAR-NK疗法有着较高的安全性、实体瘤中更好的治疗潜力等优势。但目前CAR-NK在治疗实体肿瘤方面取得的一些进展多限于基础研究，临床研究比较局限，不像CAR-T疗法开展那么广泛。最终能否成功治疗临床肿瘤，需要更多的临床研究去证实。另外，CAR-NK的不良反应虽然相对CAR-T来说要少，但并不意味着不会出现不良反应，随着CAR-NK临床研究的增多，会有更多具体应用问题随之出现。NK细胞包括如外周血NK细胞、脐带血NK细胞、NK-92细胞系等不同的NK细胞型，功能特征也不尽相同。因此如何选择合适的NK细胞亚群来扩增并构建特定有效的CAR-NK细胞也有待探索，因为构建的CAR-NK最后的治疗效果可能也不同。

CAR-NK技术的飞速发展给我们彻底治愈恶性肿瘤带来了希望。虽然在后期临床研究中可能会出现各种各样的挑战，但我们相信解决好这些问题，CAR技术将是人类对抗肿瘤的有力武器。