可降解生物镁合金在动物体内的溶血及过敏试验

崔志琼 杨 滨 甘佼弘 林 欣 徐 晟 刘 玺 张海娜 郭 振 王晔玲

(吉林大学第一医院心血管疾病诊疗中心，吉林 长春 130021)

冠状动脉疾病的发病率逐年提高，成为威胁人类生命安全的一大主要疾病，而治疗心血管疾病最常见有效的治疗措施为血管支架的植入，该方法可以将病灶部位血管撑开，促使其恢复正常，从而能缓解患者症状，避免病情的进一步发展〔1,2〕。现有的不可降解支架如金属支架、覆膜支架在经过多年的临床应用，因其存在易致血栓形成，再狭窄率高，长期抗血小板治疗及永久保留体内等不足，使得人们将目光转向生物可降解支架，其能够克服部分永久性或者药物洗脱性支架的不足，为血管再次介入手术提供了手术平台〔3～7〕。可降解金属支架作为新一代血管支架，可在早期为损伤血管提供足够的力学支撑，在不引起局部和系统毒性的前提下，其完成血管修复任务后以合适的速率可被机体降解吸收〔8〕。目前主要有镁合金、铁合金和锌合金3类可降解金属支架材料〔9〕。近年来镁合金支架发展较为迅速〔10～15〕，镁合金具有密度低、强度高、生物相容性优良、抗血小板聚集性，以及可在体内降解的优势，其降解产物对生物体无毒性，且会通过人体正常的新陈代谢途径排出〔16～18〕。因此，可降解医用镁合金也被誉为“革命性的生物金属材料”而受到全世界的关注。本实验对吉林大学工程仿生教育部重点实验室的可降解生物镁合金进行研究，观察其在动物体内溶血及过敏试验的表现。

1 材料与方法

1.1材料、动物及主要试剂与仪器 可降解生物镁合金(Mg-Sn-Zn)，来自吉林大学工程仿生教育部重点实验室。实验动物：①EWG/B豚鼠，雌雄各半，体重250～340 g,用于皮肤致敏试验;②日本大耳白家兔(CBWR/B)，体重2.3 kg，用于体外溶血性试验。试剂与仪器：2,4-二硝基氯苯，LDZ5-2型普通离心机，DR-HW-1电热恒温水温箱，高压灭菌机(韩国)。

1.2可降解生物镁合金浸提液的制备 取可降解生物镁合金材料数枚(20 mm×8 mm×2 mm)放入灭菌离心管中加入蒸馏水，超声清洁机清洗10 min后取出晾干，121℃高压灭菌20 min后烘干置于无菌的锥形瓶中，按照ISO文件要求(试样表面积/浸提介质=3 cm2/ml),加入生理盐水，放在37℃培养箱中浸提72 h,得到可降解生物镁合金浸提液，4℃保存备用。

1.3实验方法

1.3.1皮肤过敏试验 将40只豚鼠按体重性别随机分成3组：实验组即可降解镁合金浸提液组20只、阳性对照组为2,4-二硝基氯苯组10只、阴性对照组即生理盐水组10只，每组豚鼠雌雄各半。致敏：将实验组动物背部左侧脱毛备皮，去毛区每侧约3 cm×4 cm。24 h后将浸提液滴于纱布上制成的敷贴贴于去毛区皮肤上，用无刺激性胶布和固定带固定6 h，第7、14天以同样方法将浸提液纱布敷贴于豚鼠左侧背部〔19～21〕。用生理盐水作为阴性对照，阳性对照组采用2,4-二硝基氯苯配制成1%的致敏浓度，按照上述方法进行实验。激发：第28天时，实验组动物背部同样方法右侧脱毛备皮，24 h后将浸提液纱布敷贴于去毛区皮肤上，固定6 h后去除敷贴片，用蒸馏水清洗给药部位后24、 48、 72 h观察豚鼠皮肤局部过敏反应情况；阳性对照组用2,4-二硝基氯苯配制成0.1%的激发浓度，阴性对照组用生理盐水，方法同上〔21〕。根据皮肤过敏反应评分标准评分，按致敏率判断其致敏强度，过敏率=(组内出现过敏反应的动物数/该组动物总数)×100%。

1.3.2体外溶血性试验 取日本大耳家兔血约10 ml，放在装有玻璃珠的三角瓶中，振摇10 min后将纤维蛋白原去除，制备为脱纤血液，用氯化钠注射液清洗血细胞，后以2 500 r/min离心5 min至上清液呈无色透明，再将所得红细胞用氯化钠注射液配成2%的混悬液，取7支试管并依次编号，1～5号管为供试品管，6号管为阴性对照管，第7管为阳性对照管，依次加入2%红细胞混悬液和生理盐水或蒸馏水〔21〕。将各管轻轻摇匀后，放置于37℃恒温水浴中并记录30 min及1、2、3、4 h的结果。结果评判标准：①溶血：溶液呈透明红色；②红细胞凝聚：溶液中有棕红色或红棕色絮状沉淀；③无溶血：红细胞全部下沉，上层液无色澄清。

2 结 果

2.1豚鼠皮肤过敏试验 实验组及阴性对照组在去除敷料后24、48、72 h的观察结果均为皮肤无明显改变，无红斑及水肿；阳性对照组在去除敷料后均不同程度出现红斑及水肿。实验组与阴性对照组的皮肤致敏反应计分均为0,致敏率为0；阳性对照组致敏率为100%,表明其具有极强致敏性。

2.2体外溶血性试验 蒸馏水组溶液呈透明红色，表明其发生了溶血；生理盐水及生物镁合金浸提液组均可见红细胞全部下沉，上层液无色澄明，未见棕红色或红棕色絮状沉淀，二者在观察期内均无溶血及红细胞凝聚，表明降解生物镁合金浸提液对家兔红细胞无溶血作用。

3 讨 论

目前全球冠心病患病率逐年增加，血管支架植入被认为是最重要、最有效的心血管疾病诊疗技术。临床医疗界对血管支架的需求推动了支架类产品的发展创新。传统不可降解金属支架及药物洗脱支架存在长期植入引起的慢性炎症、支架内再狭窄、晚期支架血栓等弊端，可降解支架具有克服上述问题的潜在优势，在未来心血管疾病方面将发挥重要作用，因此作为新一代血管支架已得到人们广泛关注。因其直接关系到使用者的生命安全，其安全性问题更加引起民众的关注。因此，对其安全性评价尤为重要。

镁是人体所必需的一种微量元素，是人体中几种酶的必需元素，是ATP 酶的辅因子， 它具有稳定细胞膜和影响神经肌肉传导和中枢神经系统的功能，与生命的维持、身体的健康有着极其密切的关系，而且参与心血管活动的多个过程，主要为抗心律失常、预防动脉粥样硬化，其抗心律失常作用常被应用于临床治疗急性心肌梗死。主要机制如下：镁离子和钙离子相互拮抗，通过竞争离子通道和特定结合位点，镁离子可以抑制其进出肌质的活性，从而抑制心肌细胞线粒体钙离子过载引起的心律失常；镁可以减少冠状动脉痉挛从而改善局部心肌血流，此外镁影响血液凝固，抑制血小板聚集，降低高密度脂蛋白含量，抑制脂质在动脉壁的沉积从而预防动脉粥样硬化〔22〕。然而，纯镁化学性质活泼，在体内降解速率过快，镁合金则兼具优良的机械性能和可调控降解的特性，溶出的金属离子还可以被生物体吸收或排泄，最终在人体完成自身修复时完全降解消失〔23〕，人们开始探索将可降解生物镁合金用于生物医学领域。本文结果显示生物镁合金浸提液，对皮肤无潜在致敏性，对家兔红细胞也无溶血作用，说明可降解生物镁合金支架是一种很有前途的生物可降解支架医用材料。