碘乙酰胺在消化系统疾病动物模型研究中的应用概况

李建锋，谢胜，陈广文，刘礼剑，黄晓燕，杨成宁，李娟，谢洁如，戴文杰，陈明冰

(1. 广西中医药大学研究生学院，南宁 530000； 2. 广西中医药大学第一附属医院消化内科，南宁 530000)

慢性胃炎(chronic gastritis，CG)、功能性消化不良(functional dyspepsIA，FD)及溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是消化系统常见疾病，占据消化内科门诊半数以上，发病率呈现逐年上升趋势，严重危害人体身心健康，加重医疗经济负担。目前，这些疾病的病因及发病机制尚未完全明确，因此，进一步深入研究这类消化系统疾病的发病机制及药物研发，相关动物模型的建立显得尤为重要。近年来动物研究发现烷基化试剂—碘乙酰胺可基本模拟消化系统疾病如慢性胃炎、功能性消化不良、溃疡性结肠炎的病理生理机制，碘乙酰胺可作为蛋白酶抑制剂抑制蛋白酶活力而不使蛋白变[1]，具有诱导细胞缺氧、黏膜损伤、焦虑和抑郁等作用，现将碘乙酰胺在CG、FD、UC动物模型建立中的作用机制、造模方法等研究进行综述。

1 碘乙酰胺的作用机制

碘乙酰胺(iodoacetomide，IA)，是蛋白组学中半胱氨酸和组氨酸的烷基化试剂，其与半胱氨酸上的巯基(-SH)在室温下即可迅速发发生R-SH+ICH2CONH2→R-S-CH2CONH2+HI[1]不可逆反应。因此IA具有诱导细胞缺氧、黏膜损伤、焦虑和抑郁等作用。

1.1 IA诱导细胞缺氧

IA是磷酸肌酸激酶(creatine kinase, CK)的特异性抑制剂，CK被抑制后，ATP转运障碍[2]，则供能量生成严重障碍，诱导细胞缺氧，并导致肌肉运动能力下降。且无氧代谢可造成酸中毒，在将加重ATP合成障碍，还将破坏细胞器和细胞，更进一步加重缺氧并诱导细胞死亡。

1.2 IA诱导黏膜损伤

研究发现内生巯基(-SH)化合物，如谷胱甘肽对保护胃黏膜发挥着重要作用[3]，它们能够防止活性氧(reactive oxy gen species, ROS)及其代谢物参与胃黏膜损伤[4]。IA特异抑制了巯基(-SH)，从而使巯基(-SH)失去保护黏膜的作用，进而导致黏膜损伤。

1.3 IA介导蛋白质变性

蛋白质分子中各氨基酸通过肽键及二硫键结合成具有一定顺序的肽链称为一级结构。二硫键起着稳定蛋白结构及抑制聚集的作用[5]。IA具有抑制巯基(-SH)的作用，致使二硫键断裂，多肽链伸展开来，使蛋白质高级结构发生变化，从而失去生物活性。

1.4 IA诱导焦虑和抑郁

IA诱导雌性小鼠胃炎的表现出与高架十字迷宫测试(elevated plus maze test, EPMT)中所评估的焦虑相关的行为增加[6]。Luo等[7]研究发现用IA处理的雌性小鼠中皮质酮的循环水平降低，而焦虑抑郁相关行为指标显着增强，但在雄性小鼠中没有显着变化。同时指出，可能是长期胃炎增强焦虑样行为，并引起下丘脑 - 垂体 - 肾上腺轴(hypothalamic-pituitary-adrenal axis, HPA or HTPA axis)的习惯化以性别依赖方式有关，其中IA对焦虑和HPA轴活性的影响是由外周作用部位引起的。Painsipp等[8]研究中发现，IA诱导雌性大鼠胃炎中HPA轴过度活跃，而HPA轴过度活跃是焦虑抑郁症患者的共同表现[9-10]，并表明IA诱导的胃炎通过神经内分泌(HPA轴)途径导致雌性大鼠的焦虑和抑郁样行为。

2 IA在在消化系统疾病动物模型建立中的应用

2.1 慢性胃炎

CG由多种原因引起的胃黏膜的慢性炎性反应，当前我国CG患病率接近90%[11]，并且CG伴肠上皮化生发生胃癌的危险度增加[12]，在临床上应引起高度重视，故CG物模型的构建对深入研究该病的相关机制显得尤为重要。

IA具有诱发轻度胃炎的作用，并产生在感觉和酸分泌功能显著变化反应，国外学者在建立慢性胃炎大鼠模型中已多次应用[13-14]。且慢性胃炎与饮食因素具密切相关[15]，而采用IA化学刺激模损伤胃黏膜以拟人类因不良饮食习惯来造成的慢性胃炎，这种模拟病因的方式能很好地反映慢性胃炎发展的真实情况。陈娟等[16]用0.07% 的IA溶液代替饮水自由饮用4 周以诱导诱导胃炎模型，发现IA组肉眼可见胃黏膜明显充血水肿、红斑点、呈线状或片状，病理炎症中可观察到胃黏膜毛细血管扩张淤血，在胃小凹区、固有腺底部直至黏膜肌层见不同程度的淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞浸润；Lee等[17]用0.1 mL 0.15% 的IA灌胃，同时以0.15% 的IA与2% 蔗糖的混合液替饮水自由饮用建立CG雄性大鼠模型。结果发现IA组大鼠胃黏膜损伤在1 d后已经很明显，并持续了整个实验的7 d，胃组织表面可见中度胃损伤，而MPO活性显著提高；Luo等[7]选用8 ～ 9周龄SD大鼠，予0.1% 的IA溶液代饮水饮用7 d以诱导胃炎模型，发现IA组的MPO活性显著增加，研究同时发现，IA诱导的胃炎症可通过神经内分泌途径导致雌性大鼠的焦虑和抑郁样行为；Painsipp等[8]选用8 ～ 16 周龄、体重25 ～ 35 g的OF1品系雄性和雌性小鼠，以0.1% 的IA溶液代饮用水饮用7 d诱导胃炎模型，在肉眼观察中，IA组小鼠的胃、空肠和结肠黏膜改变无明显差异，并在宏观上呈现正常，但IA组小鼠中MPO活性显着升高(P< 0.01)，组织学分析显示，IA组小鼠的胃黏膜的腔侧显示结构性损伤，特征在于黏膜的腔侧被从上皮脱落的松散的黏膜细胞覆盖；Takeeda等[18]选用体重在200 ～ 230 g的雄性SD大鼠，将浓度为0.1% IA溶液代饮用水给予大鼠饮用5 d诱导胃炎。实验观察到饮用第3 天时，即引起胃黏膜糜烂性病变，且损伤严重，并发现黏膜和黏膜下层中性粒细胞浸润。饮用至第5 天时，大鼠体重较饮用前相比明显下降(P< 0.05)；Piqueras等[19]选用6 ～ 8周雄性瑞士CD-1小鼠，每只每天予0.1 mL 0.1% 的IA灌胃，同时以0.1% 的IA与2.0% 蔗糖的混合液替饮水自由饮用6 d。结果在镜下观察到IA组大鼠胃黏膜下层具有炎性浸润，包括肥大细胞、淋巴细胞和中性粒细胞；与对照组相比，IA组胃排空率差异无显著性(P> 0.05)；但基础胃酸分泌明显增加(P< 0.05)；而在体重、饮食量、饮水量均明显下降(P< 0.05)。

以IA溶液灌胃或/和代水自由饮用诱导的胃炎模型，结果均能发现MOP水平升高，MOP被广泛地作为粒细胞浸润到各种组织(包括胃肠道)的生化标志物[20]，其水平的升高反映炎症相关的嗜中性粒细胞和单核细胞浸润到组织中，故在实验中均可在组织学下发现黏膜固有层中等发现炎性细胞浸润。在IA诱导的胃炎模型中，大鼠在饮水量、体重、基础胃酸分泌及肉眼观察下的胃黏膜病变损伤程度等方面均有差异性，这些差异性可能与动物品系、IA溶液浓度、造模时间及IA的使用方式的不同相关。此外，在研究中发现，IA诱导可雌性大鼠的焦虑和抑郁样行为，并且这种焦虑和抑郁行为可能诱导雌鼠的胃炎比雄鼠更严重，这一发现将可运用于临床上CG患者常伴发焦虑或抑郁状态的研究。同时研究表明，与化学刺激物如阿司匹林、消炎痛、乙醇等造成的胃黏膜急性重度损伤模型相比，IA造成的是轻度胃黏膜损伤，且造模时间较短，是慢性浅表性胃炎的可靠模型[21]。

2.2 功能性消化不良

FD当前全球患病率为10% ～ 30%[22]，胃十二指肠运动功能紊乱和内脏高敏感是FD的重要病理生理学机制，而FD患者的抑郁、焦虑情绪和睡眠障碍发生率更高[23]，故精神心理因素与FD的发病机制密切相关。IA在诱发轻度胃炎的同时，并产生在感觉和运动功能显著变化[24]，并可导致并加重雌性大鼠的焦虑和抑郁样行为[7-8]。故采用IA诱导FD动物模型，这种模拟FD发病的方式能很好地反映FD发展的真实情况。

Liu等[25]选用10 日龄雄性SD大鼠，每天给予0.2 mL的0.1% IA与2.0% 蔗糖的混合液连续灌胃6 d，发现IA组大鼠在对胃气囊扩张(GD)的行为反应、神经反应得分均显著增加(P< 0.001)，而传入神经活化阈值、胃容量均显著较低(P< 0.001)，该实验证实了对新生儿期的胃刺激可导致成年期的慢性胃过敏和胃运动功能障碍，为FD的发病机制研究提供了一个潜在的动物模型。Liu等[26]以同样造模方式对大鼠焦虑、抑郁行为进行研究，发现在抑郁、焦虑样行为测试中，IA组糖水偏好百分比、攀爬和游泳行为、开放手臂上行走距离百分比及30 min测试期间总行程均明显降低(P< 0.05)；而5 min内不动性显著增加(P< 0.01)；进一步证实了经IA处理可诱发大鼠焦虑和抑郁样行为。张声生等[27-30]选用SPF级10日龄的SD雄性幼鼠，予0.1% IA与2.0% 蔗糖的混合液0.2 mL灌胃，连续6 d诱导FD模型，灌胃结束后各组大鼠正常饲养至7周龄，以夹尾刺激法[31-32]对模型组大鼠刺激1 周，实验发现模型组大鼠3 h摄食量、胃排空率、胃顺应性、胃肌条收缩平均频率和振幅变化率、胃体GHSR蛋白表达均显著降低(P< 0.01)；模型组大鼠胃敏感性、胃及脊髓中5-HT含量及脊髓 c-fos mRNA表达均明显升高(P< 0.05)。唐旭东等[33-35]选用10 日龄的SD雄性幼鼠，予0.1% IA与2.0%蔗糖的混合液0.2 mL灌胃，连续6 d诱导FD模型，灌胃结束后大鼠正常饲养至6 周龄予改良多平台造模法[36]进行疲劳诱发，连续14 d。实验发现模型组大鼠体重、进食量、饮水量、糖水偏好百分比、大鼠的抓握力、胃排空率、小肠推进率、血清D-木糖排泄率、胃动素含量、胃体纵行肌肌条振幅(平均振幅、Max 振幅、Min 振幅、Max-Min振幅)、胃窦环行肌肌条振幅(Max 振幅、Max-Min 振幅、平均周期频率)均明显降低(P< 0.05)；大鼠胃敏感性、乳酸值、胃体纵行肌肌条平均周期频率均明显升高(P< 0.05)；而胃窦环行肌肌条平均振幅、Min 振幅无显著性(P> 0.05)。黄穗平等[37-38]选用出生3 d的SPF级SD雄性幼鼠，于幼鼠10 ～ 16 d 时给予0.1% IA与2.0%蔗糖的混合液0.2 mL灌胃，以诱导FD模型，灌胃结束后大鼠正常饲养至8周龄后予采用水环境小平台站立法联合饥饱失常法[39-40]以诱导脾虚证FD模型，连续14 d，造模结束后，与正常组比较，模型大鼠体重、胃排空率显著降低(P< 0.01)。

新生儿时期胃肠功能是一个特别脆弱的时间窗口，故对新生儿时期胃肠进行轻度刺激可导致持续到成年期慢性胃过敏和运动紊乱。因此，实验中均选用幼鼠进行，并以0.2 mL的0.1% IA与2.0%蔗糖的混合液连续灌胃6 d诱导FD模型。实验发现，参与调节胃肠道运动调控的重要神经递质和旁分泌信号分子GHSR[41]水平明显降低，故IA可能对GHSR具有抑制作用，从而造成胃肠动力及胃酸分泌功能障碍，进而诱发FD。此外，在研究中发现中枢神经系统以及胃肠道5-HT、c-fos表达均明显升高，5-HT、c-fos表达的升高均可影响神经信号通路的改变而导致内脏敏感性增高[42]，这可能与IA对脑肠轴及其调节的相关胃肠激素有密切相关[43]。故IA能较好地模拟出FD内脏高敏感、胃顺应性降低、胃排空延缓三大病理机制，是建立FD的良好模型。

2.3 溃疡性结肠炎

溃疡性结肠炎(UC)是以局限于结肠的弥漫性黏膜炎症为特征的慢性疾病[44]。据推测我国UC患病率约为11.6/10万[45]，且具有一定的癌变倾向[46]，是当前世界医学领域研究的重点、难点之一。故构建契合UC发病特点动物模型对深入研究该病机制及药物研发至关重要。IA可诱导结肠炎症模型，且所诱导的溃疡性结肠炎在黏膜损伤、炎症、腹泻及出血等症状与人类相似[24]，能相对较好模拟结肠病变的发病机理。

Rachmilewitz等[24]以6% IA 0.1 mL溶于1 mL 1%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液注入体量为200 ～ 250 g的SD雄性大鼠回肠，结果成功诱导UC模型，为UC的发病机制研究提供了一个潜在的动物模型。Levine等[47]选用雄性Wistar大鼠，以3% IA 0.1 mL溶于1 mL 1% CMC-Na溶液给大鼠灌肠，发现IA组结肠可见混合性炎性渗出物的局灶性浅表黏膜溃疡，部分表现出隐窝脓肿在固有层的显着炎性浸润，与对照组比较，IA组炎症严重程度的参数，炎症面积、肉眼炎症严重程度和显微镜下结肠炎评分均显著升高(P< 0.05)；Hajj等[48]6% IA 0.1 mL溶于1 mL 1%CMC-Na溶液给大鼠灌肠，并于灌肠48 h后接种0.2 mL含有4×108个大肠埃希菌(EPEC)菌落单位的悬浮液，每周灌肠1次，实验周期30 d。与对照组相比，模型组大鼠体重增长率明显降低(P< 0.05)；而肉眼观察溃疡评分、MPO活性评分、TNF-α的表达显著升高(P< 0.05)。表明使用IA和肠致病性大肠埃希菌构建的UC模型，非常类似于人类UC的发病情况；Deng等[49]以6% IA 0.1 mL溶于1 mL 1% CMC-Na溶液灌肠建立成年UC SD雌性大鼠模型，与对照组相比，IA组的血管内皮生长因子(VEGF)、内皮抑制素、血管抑制素、TNF-α显著增加(P< 0.05)。Cai等[50]选用SPF级、体重150 ～ 160 g的雌性SD大鼠以6% IA 0.1 mL溶于1 mL 1% CMC-Na溶液灌肠建立UC模型，大鼠出现腹泻、血便、倦怠、毛发无光泽、体重下降，结肠局部扩张，多有连续广泛的溃疡，HE染色可见黏膜层腺体紊乱、腺体减少、透壁炎症及溃疡，肠组织中的 MPO 活性升高。

综上所述，在IA诱导UC模型的研究中，单次剂量3%或6% IA即可诱导良好的重现性结肠损伤，无论是肉眼观察还是镜下观察均可发现明显炎症。VEGF可增加结肠黏膜的血管通透性，以致损伤部位的炎症细胞浸润，从而促进持续的慢性炎症[51]；TNF-α是一种原型促炎细胞因子和在涉及溃疡性结肠炎发病机制中各种炎性过程的关键调节因子。实验发现大鼠结肠中VEGF、TNF-α显著增加，或表明IA可能通过上调VEGF、TNF-α的表达以促进炎性浸润，从而诱导UC的发生。此外，有研究指出[51]，在IA灌肠后1至2 h即可观察到血管通透性增加、大量的黏膜水肿等最初表现，6 ～ 12 h可致糜烂和溃疡，7 ～ 14 d则表现为广泛的急性和慢性炎症。故可根据时段获取相应形态学病变组织样品用于相应研究，IA诱导UC模型具有一定优势。

3 小结

IA是一种烷基化试剂，其作用于胃肠组织大分子组织蛋白使其发生烷基化而丧失生理功能，导致胃肠壁组织的损伤及胃肠动力的改变，以诱导CG、FD、UC的发生。IA建立的消化系统疾病动物模型具有以下优点：(1)剂量浓度较低，使用浓度在0.07% ～ 6% 不等；(2)造模时间较短，一般在1 ～ 7 d左右；(3)能诱导胃肠黏膜及功能改变，可基本模拟CG、FD、UC等消化系统疾病发病病理生理机制；(4)可诱导焦虑抑郁状态，以用于心理精神因素与消化系统疾病关系的相关研究；(5)为中医构建“病证结合”动物模型提供了良好的前期基础。但其中仍然存在一定的问题，需要我们重视。因动物种属、体质量、IA剂量、实验周期与麻醉状态等因素的差异，对动物的胃肠道损伤、功能改变的程度及时效也不尽相同，因而影响着造模成功与否。而在以往的实验研究中，多应用此类动物模型进行相应病理机制的分子生物学研究，但较少对IA进行药理学研究。如何制定标准的造模参数，保证模型的稳定性及相应实验的可行性与准确性，需要我们对IA诱导动物模型的造模影响因素进行深入的探讨，以为消化系统疾病的研究提供更为科学可靠的动物模型。