长爪沙鼠脑缺血模型近交系的培育及其发病机制研究进展

李长龙，杜小燕，王冬平，陈振文*

(1. 首都医科大学基础医学院，北京 100069； 2. 军事医学研究院实验动物中心，北京 100071)

2018年,第71届世界卫生组织(WHO)大会发布的信息显示，心脑血管疾病仍然是人类健康的最大“杀手”，而中国是全世界脑血管病死亡率最高的国家。随着我国老龄化社会的到来，脑血管病的发病率将呈上升趋势。在多种脑血管病发生的高危因素中，脑血管畸形是关键因素之一。脑动静脉畸形(arteriovenous malformations，AVM)会导致脑血管病易患性增强，尤其在儿童和年轻人脑血管病的发生中，AVM是脑血管病发生最根本的原因之一[1]。研究发现人的脑底动脉Willis环(circle of Willis, COW)存在多种畸形[2]，西方人群中正常结构COW的比例为42% ～ 52%[3-4]。中国人群中正常结构COW的比例仅为27%，远远低于西方人群，其中后交通支完整率为31%，前交通支完整率79%[5]。COW变异缺失会导致罹患脑血管病风险性显著增加[6]。在COW不对称的病人中，脑动脉瘤破裂的比例高达75.7%，说明COW的变异缺失还与脑动脉瘤的预后高度相关[7]。不仅如此，COW变异缺失与缺血性脑中风病人溶栓处理后的脑出血紧密相关[8]。因此，COW变异缺失是脑血管病重要风险因子和预后指标[9]。动物模型是研究脑缺血发病机制和治疗方法不可或缺的实验材料。现有的脑缺血动物模型主要分为全脑缺血模型和局灶性脑缺血模型，其中全脑缺血模型主要采用双侧结扎颈总动脉和椎动脉获取[10]。该方法能够复制大脑严重缺血和缺血再灌注模型。局灶性脑缺血模型主要通过开颅法、线栓法、栓塞法和光化学法建立。但上述模型存在手术复杂、对动物损伤大及缺血部位和范围不稳定等缺点。

长爪沙鼠是源自我国的实验动物，后传到日本和欧美等国家，因其具有独特的解剖结构及其对微生物易感性、多种肿瘤易发性等生理和行为学特征，已广泛地应用于寄生虫病、微生物、生殖、内分泌、营养、代谢及药理、肿瘤等诸多领域研究，被称为“多功能”实验动物[11-12]。目前在主要的发达国家均有商品化的长爪沙鼠出售，如Charles River公司。针对长爪沙鼠自发癫痫的特性，美国加利福尼亚大学培育了癫痫易感型(WJL/uc)和抵抗型(STR/uc)两个近交品系。日本培育了长爪沙鼠癫痫品系(MGS/ldr)[13]。长爪沙鼠被认为适宜制作脑缺血模型[14]，其优势在于，第一，长爪沙鼠成年体重约为60 ～ 80 g，适宜手术操作；第二，模型建立方法简单，手术损伤相对小，利于长时间的研究工作；第三，适宜建立全脑和半脑缺血模型或者缺血再灌注模型[15]。长爪沙鼠脑缺血模型不但用于脑缺血发病和损伤机制研究，也用于相关药物研究开发[16]。

利用长爪沙鼠建立脑缺血模型也存在不足。由于长爪沙鼠COW结构存在差异，造成仅有30%左右动物在结扎颈总动脉后出现明确的脑缺血症状[17-18]。模型成功率低造成了严重的动物浪费和研究结果不稳定，因此开发出脑底动脉Willis环变异缺失类型一致，表型性状稳定的模型群体就显得十分必要。

1 长爪沙鼠脑缺血模型高发群体的培育

首都医科大学群体来自于捕获到野生长爪沙鼠。从1982年开始实验动物化工作，在质量控制和群体培育方面做了很多工作。杜小燕等[19-20]通过大量分析，确认长爪沙鼠COW具有变异缺失特性，进一步研究证实，通过单侧结扎颈总动脉获得典型半脑缺血症状的前提是COW前交通支细小或缺失并后交通支缺失。通过对连续5代长爪沙鼠共计398只动物的分析证实，长爪沙鼠脑底动脉COW变异缺失具有遗传性[21]。该研究结果表明，通过选育的方式定向培育长爪沙鼠脑血模型群体是可行的。

首都医科大学长爪沙鼠研究团队在国家自然科学基金和国家科技支撑计划课题资助下，开展了长爪沙鼠脑缺血高发群的选育工作。由于脑血管COW类型分析具有破坏性，因此在亲代动物产子后再进行血管类型分析和模型制作，根据亲代COW类型和发病特点对子代个体进行筛选和配种，进而达到选育和富集相关基因的目的。经过8年18代的定向繁育，长爪沙鼠群体的半脑脑缺血模型成功率由普通种群的40%左右上升到70%以上，全脑缺血模型成功率可达80%以上。经过多个单位的研究证实，该群体成模率稳定，模型一致性好，已经成为脑缺血模型高发群群体。该群体对于提高实验效率、减少动物使用量和保障动物福利等方面均有重要意义。2014年1月该群体通过了专家鉴定，将为脑缺血研究和药物研发提供新的实验材料。

2 长爪沙鼠脑缺血模型近交系的培育

尽管脑缺血高发群的模型成功率有了很大提升，但是COW类型的多样性没有显著改善，为了进一步提高长爪沙鼠脑缺血模型的成模率和模型症状的一致性，固化COW类型，团队从2009年开始选择血管类型相同和表型特征一致的长爪沙鼠后代开始全同胞兄妹近交繁殖，培育长爪沙鼠脑缺血模型近交系。选育过程中，在每一代都进行血管类型分析和模型成功率测定，通过亲代血管类型和表型特征决定其后代是否留种。

近交系培育过程中会出现严重的近交衰退现象，表现为生育障碍进而导致近交系培育失败。为了保证近交系繁殖成功，采取隔代检测的方法，即子代的仔鼠出生后才检测其祖代的策略。通过对F1-F15代所有动物和F16-F20代部分动物进行了脑缺血成模率和COW缺失类型统计发现，在连续近交20代过程中单侧颈总动脉结扎模型发生率总体呈上升趋势，从F3的47.6%上升到F18、F19和F20分别达到73.17%、85.71%和88.89%；同时，COW变异缺失率也呈上升趋势，COW后交通支的缺失达到100%；前交通支的缺失率从F3代的50%上升到F18、F19和F20分别达到85.36%、80.95%和100%。

为了验证群体COW缺失和特性，选择近交F20代后77只动物进行脑解剖，显微镜下观察COW动脉环前后交通支细小或缺失，左缺失、右缺失和双侧缺失及细小等现象均按照缺失统计，否则为完整。结果显示，有59只动物出现COW缺失，前交通支缺失比例为76.62%，后交通支缺失比例100%，长爪沙鼠脑缺血模型近交系群体COW缺失比率为76.62%。目前保有F18-F23代种用动物150余对。

依据国家标准GB14923-2010 《实验动物哺乳类实验动物的遗传质量控制》中近交系实验动物的命名原则，采用大写的英文字母来命名。长爪沙鼠脑缺血模型近交系的命名应用英文Cerebral Ischemia Mongolian gerbil的首字母的大写来命名，即长爪沙鼠脑缺血模型近交系命名为CIMG。2017年通过了北京市实验动物专家委员会的专家鉴定。

3 长爪沙鼠脑缺血模型近交系的遗传检测

近交系(inbred strain)动物是至少经过连续20代的全同胞兄妹之间或亲代与子代之间交配培育而成的实验动物品系。由于长期近亲繁殖，近交系动物个体之间基因高度纯合，具有高度的遗传一致性。因此，建立长爪沙鼠近交系遗传检测方法是评估近交系培育是否成功的重要指标之一。

3.1 CIMG微卫星DNA标记检测

鉴于长爪沙鼠基因组信息未知，因此利用536对小鼠微卫星引物在长爪沙鼠基因组中扩增出微卫星位点130个，并将其注册到基因数据库中(GenBank Accession No. GU562694-GU562823, HM 02600)[21-22]。通过对PCR反应和电泳条件的优化，在长爪沙鼠群体中筛选优化获得等位基因数3个以上的39个微卫星位点。经过STR(short tandem repeat)扫描后选择多态性好、分布均匀位点作为长爪沙鼠遗传质量检测的标记位点[23-24]。在近交培育第3-20代，利用上述位点分析长爪沙鼠遗传一致性。结果显示，在28个选定位点中，有AF200947、D2Mit22、D17Mit38、D11Mit35和D5Mit31等5个位点出现变化，其中，AF200947位点从近交第4代开始由杂合子变为纯合子；D2Mit22位点从近交第11代开始由杂合子变为纯合子；D17Mit38 位点在近交过程中始终为杂合子状态；D11Mit35位点最初为纯合子，在近交第11代开始出现杂合子并一致延续至近交20代；D5Mit31位点最初为纯合子，在近交第11代开始出现杂合子并延续至近交16代，从16代开始纯合子位点并延续至近交20代。在F16代时，在28个微卫星位点中有26个已达到纯合；有2个位点仍是杂合状态；而到F20代时，有2个微卫星位点仍为杂合(D11Mit35和D17Mit38)，位点的纯合率达到92.86%。

3.2 CIMG生化位点标记检测

生化位点标记检测法是国家标准推荐的近交系动物遗传检测方法。研究采用筛选获得的长爪沙鼠26个生化位点对F9、F14、F19、F20代动物进行了遗传检测，发现在近交系的培育过程中，有3个生化位点从多态变为单态，其中位点Es-3在F14、F17和F19为多态；位点Pgm-1在F14为多态，Es-4在F14和F17为多态。F20代以上的动物进行遗传检测，其生化位点标记的电泳呈现单一性，未发现杂合型和多态性，说明这个近交系动物在上述位点均已经纯合，已选的26个生化标记纯合度达到100%。上述结果表明，CIMG已经符合近交系动物遗传质量标准。

4 长爪沙鼠脑缺血模型近交系的生物学特性

4.1 CIMG生长繁殖特性

选择近交繁育20代以上的动物，依据繁殖卡片和对不同阶段动物进行检测，统计其繁殖性能，包括：窝产仔数、初生窝重、初生平均重、离乳均重、成年体重、离乳成活率和胎间隔等。结果显示，在1 ～ 5胎，CIMG平均每胎出生(3.51±1.47)只仔鼠，其中第二胎出生动物数最高，为(4.29±1.89)只；平均窝重为(10.80±4.24)g；平均出生重(3.16±0.42)g，其中第一胎出生重较低，其他胎次平均出生差异不大；CIMG平均离乳体重为(31.03±6.30)g，8周体重平均为(49.60±5.18)g，总体仔鼠成活率为74.46%；CIMG初产日龄和胎间隔变化范围较大。结果表明，CIMG种鼠生育周期延长、生育能力下降、哺育能力下降和仔鼠畸形高等情况，导致种群的培育过程放缓。

通过对CIMG生长曲线分析发现，在1 ～ 7日龄，脑缺血动物R=0.9960，决定度R2=0.9921，在该段时间内影响体重增加的因素中日龄起了99.21%的作用；在1 ～ 8周龄，脑缺血动物R=0.9910，决定度R2=0.9819，在该段时间内影响体重增加的因素中周龄起了98.19%的作用。

4.2 CIMG血液生理生化特性

选择3月龄CIMG动物，分析其主要血液生理生化学指标，结果发现，在分析17项血液生化指标中GLU和CRE在雌雄间差异有显著性(P< 0.05)，TG在雌雄个体间差异有极显著性(P< 0.01)；在分析的22项血液生理指标中，PLT、MPV、BAS和LYM在雌雄间差异有显著性(P< 0.05)，PDW在雌雄个体间差异有极显著性(P< 0.01)；其他指标差异无显著性。表明，CIMG血液生理生化指标相对稳定，雌雄个体间差异小，品系内动物间一致率好。

5 CIMG脑血管缺失发生机制

5.1 长爪沙鼠脑血管发育时间的确定

大量研究证明，脑血管畸形是由遗传因素所致[25-26]。血管生成相关基因的对脑血管的发育发挥至关重要的作用。血管生成因子(angiogenic factor with G-patch and forkhead-associated (FHA) domain 1, AGGF1)和血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)均被认为对血管生成发挥重要调节作用[27-28]。研究显示，胚胎发育过程中在血管生成的部位均有VEGFA的表达[29]；在14日龄小鼠胚胎的大脑组织中，VEFGA基因也具有高水平的表达[29]。长爪沙鼠是新的实验动物资源，其妊娠期与常规实验动物存在差异，因此明确脑血管发育时间是探索其脑血管缺失机制中重要的前提。通过分析不同发育时间长爪沙鼠胚胎和个体脑组织AGGF1和VEGFA基因表达水平来确定其脑血管发育高峰时段。定量PCR结果发现，AGGF1和VEGFA基因在10 d胚胎时均出现表达的高峰。在个体出生后，不同发育阶段中VEGFA和AGGF1基因表达变化相对较小并且在心脏组织表达水平高于大脑的水平。提示在胚胎10 d是脑血管发育重要时段，也可能是COW发育关键时期。

5.2 VEGFA和AGGF1表达与长爪沙鼠脑血管COW发育相关性研究

选取了Willis环类型一致个体的10 d胚胎，分别利用qPCR和Western blot方法分析上述2个基因的表达水平。结果显示，两种方法对VEGFA和AGGF1表达分析结果具有一致性。AGGF1基因在不同血管类型个体中的表达水平没有显著变化。VEGFA基因在不同血管类型个体间存在差异，表明VEGFA基因的表达水平与COW类型间存在相关性。研究发现，Notch1的配体DLL4在不同COW类型的胚胎间存在显著差异。结果表明，在长爪沙鼠COW发育过程可能是VEGFA基因表达水平变化影响了Notch信号通路。

VEGFA是通过PI3K/Akt信号通路在血管生成中内皮细胞的增殖、迁移和分化等多个过程发挥重要作用[30]。因此本研究分析了不同血管类型中PI3K/Akt信号通路。结果显示，相比于COW完整胚胎，在Akt在COW变异缺失胚胎表达中表达显著降低，此外，p-Akt/Akt和p-PI3K/PI3K在COW变异缺失的胚胎中也有不同程度的下降。结果表明，PI3K/Akt信号通路影响长爪沙鼠COW的发育。

5.3 长爪沙鼠脑血管畸形基因的筛选及机制研究

脑血管发育受到多种遗传因素的影响，通过抑制消减杂交(suppression subtractive hybridization，SHH)方法可以对表达差异基因进行筛选。我们用9只长爪沙鼠构建了12个不同脑血管类型相关的抑制性消减杂交文库，通过测序和序列比对鉴定了84个基因，其中16个基因与血管发育相关。通过进一步的定量PCR验证，明确半胱氨酸组织蛋白酶抑制素C (CST3)、鸟苷酸结合蛋白alpha刺激亚基 (GNAS)、谷胱甘肽过氧化物酶4 (GPx4)和肌动蛋白抑制蛋白2 (PFN2)等4个基因与长爪沙鼠脑血管畸形相关[31]。

6 结语

近交系实验动物在生命科学研究和生物医药产业中具有广泛的用途。长爪沙鼠是源自我国的实验动物资源，由于其具有COW变异缺失的特性，使其在脑血管发育和脑缺血研究中具有独特价值。CIMG的培育成功不但丰富了我国实验动物资源，增加了品系，而且是国际上首次培育出脑缺血长爪沙鼠近交系。CIMG解决了长爪沙鼠脑缺血模型发生率低的问题，减少了动物使用量，提高了研究结果的可信度和稳定性，促进了脑缺血和缺血再灌注的发病机制和治疗方法研究，随着该模型动物的推广应用，必将推动医学生物学及药学研究进程。