中药诱导骨髓间充质干细胞成软骨及成骨分化的研究进展*

潘慧欣，崔元璐

（天津中医药大学中医药研究院，天津 300193）

骨髓间充质干细胞（BMSCs）是存在于骨髓中的一种非造血功能的干细胞，具有强大的自我更新能力、多向诱导分化能力，兼具多器官归巢能力及免疫原性低的优势，在组织工程和再生医学领域作为种子细胞具有广阔的应用前景，有望为临床上难以治愈的骨科疾病提供新的治疗策略。近年来，随着对BMSCs研究的深入，其在慢性骨科疾病治疗中的前景越发突显出来。以往研究中多采用一些化学物质及细胞因子，对BMSCs诱导分化，但由于价格昂贵和安全性问题而无法广泛应用于临床实践中。研究者把目光瞄准传统中药，选择具有滋补肝肾、活血化瘀、补气养血等功效的中药及其有效成分作为诱导剂，尝试利用中药对BMSCs进行诱导分化并取得了良好的效果，笔者就中药诱导BMSCs成软骨分化和成骨分化两个方面进行综述，以期为骨科疾病的防治研究提供参考。

1 中药诱导BMSCs成软骨分化

1.1 中药复方诱导BMSCs成软骨分化 中药复方多成分、多靶点、多机制的特点给中药复方的药理研究增加了难度，血清药理学的提出为中药复方的研究提供了新的思路。中药复方应用于诱导BMSCs成软骨分化的研究，涉及软骨相关标志物的表达分析及信号通路的机制研究，主要涉及两个方面。

1.1.1 中药复方直接加入细胞培养体系中的研究 透骨消痛方（剂量200 μg/mL）在转化生长因子-β1（TGF-β1）协同条件下可诱导体外培养的大鼠BMSCs成软骨分化，其作用机制与活化Indian hedgehog（IHH）信号通路有关[1]。

1.1.2 中药复方制备成含药血清应用于BMSCs成软骨分化的研究 研究发现右归饮含药血清促进大鼠BMSCs成软骨分化的机制与抑制丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）信号通路的4个关键基因MAPK13，MAPK14，肿瘤坏死受体相关因子6（TRAF-6）和MAP3K7中的某个或全部基因的表达，上调miR-24-3p的表达，阻断p38 MAPK信号通路的部分通路有关[2]；透骨消痛颗粒含药血清可诱导体外培养的大鼠BMSCs成软骨分化，且效果强于软骨诱导剂[3]；此外，龟鹿二仙汤含药血清也可诱导兔BMSCs成软骨分化[4]。

1.2 中药提取物诱导BMSCs成软骨分化 中药提取物在质量控制方面较中药复方更有优势。其应用于BMSCs成软骨分化的研究主要是关于软骨功能表达及参与的信号通路的机制研究。主要分两方面。

1.2.1 中药提取物制备成含药血清应用于BMSCs成软骨分化的研究 牛膝提取物含药血清可上调转录因子 SOX9，蛋白聚糖（Aggrecan），Ⅱ型胶原（collagenⅡ）mRNA和蛋白表达，证明其可诱导体外培养的兔BMSCs成软骨分化[5]；5%雪莲花醇提取物可上调collagenⅡ和Aggrecan mRNA表达，对大鼠BMSCs成软骨分化有促进作用[6]。

1.2.2 中药提取物直接加入细胞培养体系中的研究 应用骨碎补提取液、熟地黄提取液分别对体外培养的大鼠BMSCs进行成软骨分化诱导，发现骨碎补提取液可促进collagenⅡ表达，而熟地黄提取液则不能[7]；中华眼镜蛇毒液中提取出来的神经生长因子对体内软骨损伤修复和体外培养的兔BMSCs成软骨分化均有促进作用，其促进BMSCs成软骨分化机制与酪氨酸激酶A（TrkA）激活磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶 B（Akt）和 MAPK/细胞外调节蛋白激酶（ERK）信号通路有密切的关系[8]。

1.3 中药单体诱导BMSCs成软骨分化 中药单体较单味中药或中药复方成分单一，纯度更高，更利于进行精准的分子机制研究。应用于BMSCs成软骨分化的中药单体，涉及软骨相关标志物表达的研究及软骨功能相关基因表达的研究，少有关于信号通路的机制研究。主要为中药单体直接加入到细胞培养体系的体外研究，按其化学成分综述如下。

黄酮类化合物：低浓度柚皮苷与经典诱导液联合应用于体外培养的大鼠BMSCs成软骨分化，可明显增加糖胺聚糖（GAG）的分泌量，而柚皮苷单独使用时并不能促进BMSCs成软骨分化，说明柚皮苷对经典诱导剂促进大鼠BMSCs成软骨分化具有协同作用[9]；淫羊藿苷可显著上调collagenⅡ、Aggrecan的表达，证实淫羊藿苷可促进大鼠BMSCs成软骨分化[10]，且淫羊藿苷的诱导效果比单纯软骨诱导剂更好，不会使BMSCs在软骨分化过程中肥大化[11]；淫羊藿素能促进生长分化因子-5（GDF-5）诱导大鼠BMSCs成软骨分化，其作用机制可能与Wnt/βcatenin信号转导通路密切相关[12]。萜类及多酚类化合物，考察白术的活性成分三环倍半萜和转化生长因子（TGF-β1）与茶黄素联合应用诱导体外培养的人BMSCs成软骨分化作用，都应用到了甲苯胺蓝染色法、collagenⅡ免疫组化染色法，结果均呈阳性，证明二者皆有促进BMSCs成软骨分化的作用[13-14]。多肽类化合物，鹿茸多肽可提高GAG含量、上调collagenⅡ的mRNA表达，进而促进体外培养的兔BMSCs成软骨分化[15]。

2 中药诱导BMSCs成骨分化

2.1 中药复方诱导BMSCs成骨分化 应用于诱导BMSCs成骨分化的中药复方，涉及成骨相关标志物表达的研究、成骨相关基因及蛋白的表达和相关信号通路的机制研究。主要分为以下两个方面。

2.1.1 中药复方直接加入细胞培养体系中的研究 梁祖建等研究补肾调肝方水提液（剂量1mg/mL）对体外培养的大鼠衰老BMSCs成骨分化的影响，发现其可使矿化钙结节数量明显增多，提示补肾调肝方可促进衰老BMSCs成骨分化[16]。中药生肌液也可促进体外培养的兔BMSCs成骨分化，且1：20生肌液组诱导效果最佳[17]。

2.1.2 中药复方制备成含药血清应用于BMSCs成骨分化的研究 补肾填精方（又称骨康方）可诱导体外培养的大鼠及小鼠BMSCs成骨分化，其促进BMSCs成骨分化的机制与多条信号通路有关，可使成骨标记物Runt相关转录因子2（RUNX2）及p38、激活转录因子（ATF-2）蛋白及基因表达上调，提示其作用机制与激活p38信号通路有关[18]，可显著上调Wnt/β-catenin信号通路主要蛋白β-连环蛋白、低密度脂蛋白受体相关蛋白5、T细胞因子的表达，提示其作用机制与Wnt/β-catenin信号通路密切相关[19]；研究发现左归丸含药血清可促进大鼠BMSCs成骨分化[20]，可使成骨相关基因表达上调，而基因甲基化率下调，提示其作用机制与去甲基化的表观遗传调控机制相关[21]；青娥方含药血清可提高ALP活性、上调TGF-β1 mRNA表达，促进分离自绝经后骨质疏松症的小鼠BMSCs成骨分化[22]。

2.2 中药提取物诱导BMSCs成骨分化 应用于诱导BMSCs成骨分化的中药提取物，多为植物药提取物，具体分述如下。

巴戟天多糖可促进大鼠BMSCs成骨分化，其作用机制可能与激活p38 MAPK信号通路有关[23]；牛膝提取物可通过核因子κB受体活化因子/核因子κB受体活化因子配体/骨保护素（RANKL/RANK/OPG）信号通路的调节预防激素引起的激素性股骨头坏死，减轻激素诱导的骨退化，侧面说明牛膝提取物可促进小鼠BMSCs成骨分化[24]。升麻提取物也可促进体外培养的大鼠BMSCs成骨分化，其机制与雌激素受体/一氧化氮/环磷酸鸟苷（ER/NO/cGMP）信号通路有关[25]。杜仲醇提取物可促进大鼠BMSCs成骨分化，其作用机制主要与响应Wnt信号通路中的跨膜受体卷曲蛋白2（Fzd2）和Fzd3受体分子有关[26]。

2.3 中药单体诱导BMSCs成骨分化 应用于BMSCs成骨分化的中药单体，涉及成骨相关基因、蛋白表达及信号通路的机制研究。主要为中药单体直接加入到细胞培养体系的体外研究，按中药单体的化学成分综述如下。

多糖类成分：黄精多糖可提高碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素（OCN）、Ⅰ型胶原氨基端肽（PINP）、骨形态发生蛋白2（BMP2）、骨涎蛋白的表达进而促进体外培养的小鼠BMSCs成骨分化[27]。醌类化合物：大黄素不仅可促进去卵巢小鼠BMSCs成骨分化，同时还能抑制其向成脂分化[28]。苯丙素类化合物：异补骨脂素可提高碱性成纤维细胞因子，胰岛素样生长因子-1，Osterix和RUNX2的mRNA表达来促进BMSCs成骨分化[29]。黄酮类化合物：包括金雀异黄酮、淫羊藿总黄酮、淫羊藿苷、淫羊藿次苷和槲皮素。金雀异黄酮促进小鼠BMSCs成骨分化的机制可能与激活p38 MAPK信号通路有关[30]。淫羊藿总黄酮含药血清可促进人及大鼠BMSCs成骨分化，其作用机制与BMP和Wnt/β-catenin信号通路相关[31]；淫羊藿苷可促进大鼠、山羊及人BMSCs成骨分化，且作用机制与BMP-2，OCN，Osterix和RUNX2mRNA表达上调有关[32-33]；淫羊藿苷成骨能力，与淫羊藿次苷Ⅱ比较，淫羊藿次苷Ⅱ诱导效果更佳，其促进大鼠BMSCs成骨分化的机制与激活雌激素信号通路有关[34]；槲皮素促进大鼠BMSCs成骨分化的作用机制与激活ERK1/2和c-Jun氨基末端激酶（JNK）信号通路或ERK和p38信号通路有关[35-36]。多酚类化合物：白藜芦醇可通过抑制NF-κB信号通路来保护由TNF-α引起的小鼠BMSCs成骨分化抑制[37]。

3 问题与展望

目前，中药诱导BMSCs成软骨及成骨分化的研究已取得了相当多的成果，但仍存在一些亟待解决的问题。首先，除中药单体外，复方中药及中药提取物成分复杂，需进一步确定具诱导分化作用的有效成分，含药血清成分也很复杂，且目前缺乏制备含药血清的标准操作规程和质量控制体系。其次，目前将中药复方直接加入细胞培养体系用于诱导BMSCs成软骨及成骨分化的体外研究较少，缺少文献支持，导致一些研究的给药剂量可能过大[1，16]。在实际临床应用中，受药物本身生物利用度及首过效应影响，通过口服方式在体内的血药浓度无法达到体外研究选择的剂量，对骨科疾病的防治没有实际意义。另外，中药诱导BMSCs成软骨及成骨分化机制复杂，目前对于发挥作用的相关信号通路分子机制研究较少。未来研究应更多地结合药代动力学、转录组学、蛋白组学等现代研究手段，深入探明中药诱导BMSCs成软骨及成骨分化过程中发挥作用的有效成分以及机制通路和作用靶点，为中药应用于诱导BMSCs分化治疗骨科疾病提供更可靠的依据。